分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：7大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備2015年3月1課件作者:蔣華云什么是感受態(tài)？宿主大腸桿菌（E. coli DH-5） （R-，M-，Amp-）感受態(tài)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)2012-4-16課件作者:蔣華云2015年3月2課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的方法和技術(shù)。為接下來(lái)的DNA重組與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供感受態(tài)細(xì)胞。2015年3月3課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)原理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌經(jīng)低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。2015年3月4課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)原理在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新

2、的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài),以攝取外源DNA。2015年3月5課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2015年3月6課件作者:蔣華

3、云實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞)。2015年3月7課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)原理目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法CaCl2法 CaCl2 法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2 法使用廣泛。RbCl(KCl)法2015年3月8課件作者:蔣華云儀器、材料與試劑 【儀器】超凈工作臺(tái)冷凍離心機(jī)恒溫?fù)u床70冰箱1mL、200

4、L移液槍（配套槍頭）10mL移液管吸耳球100mL 離心管1.5mL小指管【材料與試劑】大腸桿菌DH5（R-，M-，Amp-） LB液體培養(yǎng)基0.1mol/L CaCl2溶液30%甘油2015年3月9課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)步驟（一）受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落，接種于35mL LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（12h左右）。將該菌種懸液以1:100的比例接種，取500L菌液轉(zhuǎn)接到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h至OD600 0.5左右。2015年3月10課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)步驟（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意：以下操作在超凈工作臺(tái)完成。） 將菌液

5、轉(zhuǎn)入100mL離心管中，冰上放置10min。在4下，4000r/min離心10min。棄去上清，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。用冰上預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min。04 4000r/min離心10min，棄去上清，加入2mL預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置（務(wù)必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制備）2015年3月11課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)步驟（三）感受態(tài)細(xì)胞的分裝與凍存在2mL制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入2mL30%甘油（即1:1體積，甘油終濃度15%）,輕輕混勻。將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份200L (1.5mL小指管)，液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入-70冰箱保存。（如果沒(méi)有液氮，可以將分裝的感受態(tài)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入-70冰箱保存。）2015年3月12課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)分組全班分為2大組，每大組培養(yǎng)50mL菌液，最后每人制備得到1支200L的感受態(tài)細(xì)胞，全班至少保存32支感受態(tài)細(xì)胞。另外，沒(méi)有到超凈工作臺(tái)操作的學(xué)生可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小量感受態(tài)的模擬制備。（非無(wú)菌條件下，制備完成后不保存。）2015年3月13課件作者:蔣華云