微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)四 產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的鑒定（續(xù)）

1、實(shí)驗(yàn)四 產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的鑒定（續(xù)）電泳結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 利用NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定菌種http:/Bacillus thuringiensis 蘇云金芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST，分析篩選的微生物屬于什么種屬。進(jìn)化樹實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析根據(jù)上述進(jìn)化樹，分析本班級分離到的產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的種屬特征有什么規(guī)律實(shí)驗(yàn)五 淀粉酶產(chǎn)生菌的 紫外誘變育種第二模塊 產(chǎn)淀粉酶微生物的篩選和選育觀察紫外線對產(chǎn)生淀粉酶細(xì)菌的誘變效應(yīng)；學(xué)習(xí)并掌握紫外線誘變育種的方法；熟悉有關(guān)微

2、生物突變體的篩選方法以及篩選培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)思路。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理（一）誘變誘變（mutagenesis）是指用物理、化學(xué)或生物因素誘導(dǎo)生物體的遺傳特性發(fā)生變異的方法。對微生物而言，采用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變頻率大幅度提高，然后用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選符合育種要求的突變株，供生產(chǎn)或科研用。（二）常用的各類誘變劑物理誘變劑紫外線、快中子、x射線、射線、射線、激光、離子束化學(xué)誘變劑堿基類似物2氨基嘌呤、5溴尿嘧啶、8氮鳥嘌呤與堿基反應(yīng)的物質(zhì)硫酸二乙酯、甲基硫酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基甲基脲、亞硝基乙基脲、亞硝酸、氮芥、四硝基喹啉、乙烯亞胺、羥胺等在DNA分子

3、中插入或缺失一個或幾個堿基吖啶類染料生物誘變劑噬菌體、轉(zhuǎn)座子（三）紫外線誘變機(jī)理DNA對紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。紫外線引起DNA結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA鏈的斷裂、堿基破壞。其最主要的作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。（三）紫外線誘變機(jī)理紫外線具有致死和誘變的雙重效應(yīng)，現(xiàn)代育種理論認(rèn)為，當(dāng)誘變的微生物致死率在75%-80%時，產(chǎn)量性狀正突變率較高。因此需要測定微生物經(jīng)紫外線照射后的致死率，確定最佳的照射時間。紫外線雖然對生物體構(gòu)成殺傷力，但是穿透能力很弱，不能穿透玻璃、衣物和紙張等。（四）光

4、修復(fù)現(xiàn)象經(jīng)紫外線損傷的DNA，能被可見光修復(fù)！因此為了避免細(xì)菌光復(fù)活，用紫外線照射處理時以及處理后的操作應(yīng)該在紅光下進(jìn)行，并且將照射處理后的微生物置于暗處培養(yǎng)。光修復(fù)酶實(shí)驗(yàn)器材1.菌種 誘變出發(fā)菌株：自土壤分離的淀粉酶產(chǎn)生菌菌株2.培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基3.主要試劑 無菌水、碘液4.主要器皿 紫外交聯(lián)儀、離心管、移液器、離心機(jī)、玻璃涂布棒等實(shí)驗(yàn)步驟（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備各組挑選一株產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，用無菌的接種環(huán)，從菌種斜面保存管挑取少量菌落，接種到試管液體培養(yǎng)基。每組接種一支。置于30、220rpm的搖床上培養(yǎng)8小時。（二）平板制作融化淀粉培養(yǎng)基，每組倒6塊平板，在平板上做好標(biāo)識。

5、處理 + 10-6處理 + 10-7處理 + 10-8未處理 + 10-6未處理 + 10-7未處理 + 10-8（三）細(xì)菌懸液制備取液體培養(yǎng)物（培養(yǎng)了8h）0.5mL于dorf管中，每組2管，8000rpm，離心5min，棄上清；每管菌體用1mL無菌水洗滌一次， 8000rpm，離心5min，棄上清；每管再各加1mL無菌水制成菌懸液。（四）稀釋涂布稀釋菌液：將菌懸液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋（在dorf管中進(jìn)行），得到；涂布平板：分別取10-6、10-7、10-8三個濃度的菌懸液0.1ml涂布平板，每個稀釋度涂布2塊平板。注意無菌操作、涂布均勻，靜置5min。（五）紫外誘變以下操作需在避光條件下進(jìn)行將紫外交聯(lián)儀打開預(yù)熱20分鐘；將10-6、10-7、10-8平板置于紫外誘變箱中，打開皿蓋，照射200102J/cm2（單號排）或者100102J/cm2 （雙號排），然后迅速蓋上皿蓋；將上述平板和未處理的平板置于筐中，30避光倒置培養(yǎng)24小時。 （六）試管轉(zhuǎn)接將試管斜面進(jìn)行二次轉(zhuǎn)接。轉(zhuǎn)接方法如下圖所示。（七）觀察、分析結(jié)果（七）觀察、分析結(jié)果觀察誘變效應(yīng)：分別對處理和未處理的10-6、10-7、10-8平板上鋪碘液，測量淀粉水解圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（H/C比值），比較處理和未處理組的數(shù)值，說明誘變效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)記錄計(jì)算并記錄經(jīng)紫外照射后的細(xì)菌存活率和致