第十三章核酸與蛋白質(zhì)的合成及基因工程

1、 第三篇 基因信息的傳遞第八章 生物氧化與氧化磷酸化第九章 糖代謝第十章 脂類與脂類代謝第十一章 蛋白質(zhì)降解及氨基酸代謝第十二章 核酸的降解與核苷酸代謝第十三章 核酸和蛋白質(zhì)的生物合成第十四章 物質(zhì)代謝的聯(lián)系與調(diào)節(jié) DNA的生物合成 -復(fù)制中心法則(Central dogma)第一節(jié) DNA的復(fù)制一、 DNA復(fù)制的基本規(guī)律二、 DNA復(fù)制的酶學(xué)三、 DNA生物合成基本過程四、 逆轉(zhuǎn)錄第一節(jié) DNA的復(fù)制一、 DNA復(fù)制的基本規(guī)律二、 DNA復(fù)制的酶學(xué)三、 DNA生物合成基本過程四、 逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子

2、代DNA一、半保留復(fù)制 (semiconservative replication)二、雙向復(fù)制 (bidirectional replication)三、半不連續(xù)復(fù)制 (semi-discontinuous replication)一、 半保留復(fù)制(semiconservative replication)概念：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整接受過來，另一股單鏈則完全重新合成，兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)

3、方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 二、雙向復(fù)制(bidirectional replication)oriA BA. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉原核生物DNA雙向復(fù)制53oriorioriori535533553復(fù)制子3真核生物DNA多復(fù)制子復(fù)制三、半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand)。復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈(lagging strand)。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡

4、崎片段(okazaki fragment)。 后隨鏈(lagging strand)3535解鏈方向35335前導(dǎo)鏈(leading strand) 前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制 復(fù)制的半不連續(xù)性岡崎片段 (okazaki fragment) DNA復(fù)制的酶The Enzyme of DNA Replication復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 53CGA參與DNA復(fù)制的物質(zhì) 模板(template) : 解開成單鏈的DNA母鏈底物(substrate): dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)引物(primer): 提供3

5、-OH末端使dNTP可以依次聚合聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫 為 DNA-pol其他的酶和蛋白質(zhì)因子一、解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。E.coli：DnaB二、單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈完整 10 8 局部解鏈后三、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase) 解鏈過程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵 拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶分 類拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷D

6、NA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷DNA分子兩股鏈；松弛負(fù)超螺旋，不需要ATP，不作用正超螺旋。利用ATP供能， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)，連接斷端。作用機(jī)制 四、引物酶(primase)： 特殊的RNA 聚合酶 復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶 3535解鏈方向35335五、DNA聚合酶(DNA polymerase)全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1. 53 的聚合活性：以DNA為模板合成DNA 2. 核酸外切酶活性： 53

7、35 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性切除引物和突變的 DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。 核酸外切酶活性 （一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 功能： 53聚合酶活性、 53 和35外切酶活性 復(fù)制中的錯(cuò)誤校讀，復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補(bǔ)。DNA-pol （109kD）DNA-pol （90kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 它可能參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)

8、修復(fù)。 功能：原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶 DNA-pol (130kD/400kDa)催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)+-+5 外切酶活性+ 5外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的DNA聚合酶（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性(主要酶) 復(fù)制的主要酶，兼有解螺旋酶活性參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)空隙的作用（DNA-pol)。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DN

9、A-pol HO5335DNA連接酶ATPADP5353目 錄六、DNA連接酶(DNA ligase)2.連接的是雙鏈中的單鏈缺口1.斷端的3-OH末端， 5- P末端3.需要ATP復(fù)制中起最后接合缺口作用。DNA修復(fù)、重組及剪接中起縫合缺口作用?；蚬こ痰闹匾ぞ呙钢?。 DNA連接酶功能DNA生物合成過程The Process of DNA Replication復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供3-OH末端。打開雙螺旋防止復(fù)螺旋單鏈結(jié)合蛋白解鏈酶引物引物酶DnaA辨認(rèn)并結(jié)合起始位點(diǎn)合成（一）復(fù)制的起始：3535引物是由引物酶催化合成的短鏈R

10、NA分子。 引物3 HO5引物酶（二）復(fù)制的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol1. 前導(dǎo)鏈的合成前導(dǎo)鏈：順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈。2. 后隨鏈的合成后隨鏈：復(fù)制方向與解鏈方向相反，為不連續(xù)復(fù)制，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈。復(fù)制中位于后隨鏈上的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處

11、匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止555RNA酶OHP5DNA-poldNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶后隨鏈上不連續(xù)性片段的連接 1.親代DNA為模板，嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)規(guī)律；2.復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)聚合酶對(duì)堿基的選擇功能；3. 復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的即時(shí)校讀功能；4.錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制DNA復(fù)制具有保真性至少要依賴三種機(jī)制： 逆轉(zhuǎn)錄Reverse Transcription一、概念 逆轉(zhuǎn)錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導(dǎo)下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈。RNADNA 逆轉(zhuǎn)錄

12、酶David BaltimoreHoward M. Temin （Dec 10, 1934 Feb 9, 1994 ）（Mar 7, 1938 ） 因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)而獲1975年諾貝爾獎(jiǎng)的三位科學(xué)家二、逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 催化逆轉(zhuǎn)錄過程的酶稱逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三種酶活性： RNA依賴的DNA聚合酶 RNA酶 DNA依賴的DNA聚合酶 HIV-1 reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type 1 M-MLV reverse transcriptase fr

13、om the Moloney murine leukemia virus AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus Telomerase reverse transcriptase that maintains the telomeres of eukaryotic chromosomes 三、逆轉(zhuǎn)錄過程RNA 模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNARNA酶單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄Retroviral Reverse Transcription四、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生

14、物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了病毒致癌理論。 一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制二、DNA復(fù)制的酶學(xué)解螺旋酶結(jié)合蛋白SSB拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶DNA聚合酶DNA連接酶總 結(jié)三、 DNA生物合成過程復(fù)制的起始復(fù)制的延長(zhǎng)復(fù)制的終止四、 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄的概念逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄的過程逆轉(zhuǎn)錄意義基因的轉(zhuǎn)錄Transcription一、 轉(zhuǎn)錄的酶和模板二、 轉(zhuǎn)錄過程三、 轉(zhuǎn)錄后修飾轉(zhuǎn)錄 (transcription) 生物體以DNA為模板合成RNA的過程。 轉(zhuǎn)錄RNADNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料: NTP (

15、ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: 單鏈 DNA酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子模板和酶Templates and Enzymes一、轉(zhuǎn)錄模板 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription) 1.結(jié)構(gòu)基因(structural gene): DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段 。 2.模板鏈(template strand): DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，也稱作有意義鏈或Watson鏈。 編碼鏈(coding strand): DNA雙鏈中與模板鏈相對(duì)的單鏈，不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也稱為反義鏈或Cri

16、ck鏈。 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄含義 在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。5GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 5NAla Val His Val C編碼鏈模板鏈5GCAGUACAUGUC 3mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向二、RNA聚合酶（RNAP）（一）原核生物的RNA聚合酶原核生物的RNA聚合酶(MM400 kDa) 9 000 促進(jìn)RNAP組裝和穩(wěn)定RNAP核心酶 (core enzyme)全酶 (holoenzyme)RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)

17、的結(jié)合 轉(zhuǎn)錄泡（transcription bubble）真核生物RNA聚合酶三、模板與酶的辨認(rèn)、結(jié)合原核生物一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位稱為操縱子(operon)，包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。 5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol與RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，稱為啟動(dòng)子(promoter)。開始轉(zhuǎn)錄T T G A C AA A C T G T-35 區(qū)(Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 區(qū)1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognition

18、 site) 55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因33 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強(qiáng)子 順式作用元件 結(jié)構(gòu)基因-GCGC-CAAT-TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列cis-acting element順式作用元件順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。順式作用元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。順式作用元件本身不編碼任何蛋白質(zhì),僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn)，要與反式作用因子相互作用而起作用。反式作用因子(trans-acting factor)是指能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列

19、上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，可通過另一基因的特異的順式作用元件相互作用，從而激活另一基因的轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)節(jié)蛋白稱反式作用因子。 轉(zhuǎn)錄過程The Process of Transcription（一）轉(zhuǎn)錄起始1. RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。2. DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。原核生物的轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄起始需解決的問題：2. DNA局部雙鏈解開1. RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合 3. 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

20、:5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi轉(zhuǎn)錄起始過程（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，沿著DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPiRNA-pol(核心酶)DNARNA53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶依賴Rho ()因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止（三）轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。 分類A T P1. 依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止2. 非依

21、賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止區(qū)，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUU. UUUU.5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUU

22、UUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理 使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5pppG5 335RNA-pol原核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾Post-transcriptional Modification in ProkaryoterRNA前體的加工甲基化6500個(gè)核苷酸核酸內(nèi)切酶RNase、P核酸外切酶Structure of E. coli 30S pre-rRNArRNA前體的加工tRNA的加工包括：核酸內(nèi)切酶tRNA兩端切斷； 核酸外切酶從兩端向內(nèi)切去多余序列：修剪；在3-端加

23、CCAOH序列;切除居間序列；核苷酸的修飾與異構(gòu)化。tRNA的加工真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾Post-transcriptional Modification in Eukaryote一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）首、尾的修飾 5端形成 帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)帽子結(jié)構(gòu)（二）mRNA的剪接1. hnRNA 和 snRNA 核內(nèi)的初級(jí)mRNA稱為雜化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)snRNA (small nuclear RNA)核內(nèi)的蛋白質(zhì)小分子核糖核蛋白體（snRNP）snRNA真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干

24、個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。 斷裂基因(split gene)CABD編碼區(qū) A、B、C、D非編碼區(qū)因發(fā)現(xiàn)斷裂基因而獲1993年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)的Richard J Robert and Phllip A Sharp2. 外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron) 外顯子在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子斷裂基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。 雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾二、核 酶具

25、有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(ribozyme)四膜蟲rRNA內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式5-端核苷酸序列最簡(jiǎn)單的核酶二級(jí)結(jié)構(gòu)槌頭狀結(jié)構(gòu)(hammerhead structure)底物部分通常為60個(gè)核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu) 除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。 核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對(duì)中心法則作了重要補(bǔ)充；核酶的發(fā)現(xiàn)是對(duì)傳統(tǒng)酶學(xué)的挑戰(zhàn)；生命起源的貢獻(xiàn);利用核酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成人工核酶 。 一、轉(zhuǎn)錄的酶和模板轉(zhuǎn)錄模板RNA聚合酶模板與酶的辨認(rèn)、結(jié)合二、轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄終止三、真

26、核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾真核生物的帽子，尾巴，剪切總 結(jié)蛋白質(zhì)的生物合成(翻譯)Protein biosynthesisTranslation蛋白質(zhì)的生物合成，即翻譯，就是將核酸中由 4 種核苷酸序列編碼的遺傳信息，通過遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的排列順序 。核苷酸三聯(lián)體決定氨基酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系主要內(nèi)容一、 蛋白質(zhì)生物合成體系二、 蛋白質(zhì)生物合成過程三、 蛋白質(zhì)合成后加工和輸送蛋白質(zhì)合成體系Protein Biosynthesis System 20種氨基酸(AA)作為原料酶及眾多蛋白因子 如IF、eIF ATP、GTP參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)： 三種RNAmRNA（messe

27、nger RNA）rRNA（ribosomal RNA）tRNA（transfer RNA）一、翻譯模板mRNA及遺傳密碼 mRNA是遺傳信息的攜帶者遺傳學(xué)將編碼一個(gè)多肽的遺傳單位稱為順反子(cistron)。原核細(xì)胞中數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順反子(polycistron) mRNA 。真核一個(gè)mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)，為單順反子(single cistron) mRNA。 原核生物的多順反子真核生物的單順反子非編碼序列核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子終止密碼子編碼序列PPP53蛋白質(zhì)PPPmG -53蛋白質(zhì) mRNA上存在遺傳密碼mRN

28、A分子上從5至3方向，由AUG開始，每3個(gè)核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼(triplet coden)。起始密碼(initiation coden): AUG 終止密碼(termination coden): UAA，UAG，UGA 遺傳密碼表從mRNA 5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(Open Reading Frame, ORF)。 1. 連續(xù)性(commaless)遺傳密碼的特點(diǎn)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。 基因損

29、傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致框移突變(frameshift mutation)。 Tyr Gly Ser ArgPro Thr Asp2. 簡(jiǎn)并性(degeneracy)遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個(gè)密碼子外，其余氨基酸有2、3、4個(gè)或多至6個(gè)三聯(lián)體為其編碼。3. 通用性(universal)蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。 少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。4. 擺動(dòng)性(wobble)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA的反密碼需要通過堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼反向配對(duì)結(jié)合，但反密碼與密碼間不嚴(yán)格遵守常見的堿基配對(duì)規(guī)律，稱為擺動(dòng)配對(duì)。 U

30、擺動(dòng)配對(duì)A U密碼子、反密碼子配對(duì)的擺動(dòng)現(xiàn)象tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U, C, AA, GU, CUG二、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置原核生物真核生物核蛋白體小亞基大亞基核蛋白體小亞基大亞基S值70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白質(zhì)rpS 21種rpL 36種rpS 33種rpL 49種 不同細(xì)胞核蛋白體的組成 核蛋白體的組成原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位(peptidyl si

31、te)E位：排出位(exit site)三、tRNA與氨基酸的活化反密碼環(huán)氨基酸臂氨基酸 + tRNA氨基酰- tRNAATP AMPPPi氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase) 氨基酸的活化第一步反應(yīng)氨基酸 ATP 氨基酰-AMP PPi 第二步反應(yīng)氨基酰-AMP tRNA 氨基酰-tRNA AMP E氨基酰-tRNA合成酶對(duì)底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreading activity) 。氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNA

32、Met tRNAfMet 蛋白質(zhì)生物合成過程 The Process of Protein Biosynthesis肽鏈合成的起始(initiation)肽鏈合成的延長(zhǎng)(elongation)肽鏈合成的終止(termination )整個(gè)翻譯過程可分為 ：一、肽鏈合成起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物 (translational initiation complex)。原核、真核生物各種起始因子的生物功能 e（一）原核生物翻譯起始復(fù)合物形成1. 核蛋白體大小亞基分離；2. mRNA在小亞基定位結(jié)合；3. 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； 4. 核蛋白體大亞

33、基結(jié)合。IF-3IF-11. 核蛋白體大小亞基分離AUG53IF-3IF-12. mRNA在小亞基定位結(jié)合S-D序列：mRNA 起始密碼前的一段富含嘌呤核苷酸的序列,可與核糖體小亞基16S-rRNA上富含嘧啶序列相結(jié)合。 IF-3IF-1IF-2GTP3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )結(jié)合到小亞基AUG5350SIF-3IF-1IF-2GTPGDPPi4. 核蛋白體大亞基結(jié)合，起始復(fù)合物形成AUG53IF-3IF-1AUG53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi（二）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；起始氨基酰-tRNA結(jié)合；mRNA在核蛋白體小亞基準(zhǔn)

34、確就位；核蛋白體大亞基結(jié)合。二、肽鏈合成延長(zhǎng)指根據(jù)mRNA密碼序列的指導(dǎo)，次序添加氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止的過程。又稱為核蛋白體循環(huán)(ribosomal cycle)包括以下三步：進(jìn)位(entrance)成肽(peptide bond formation)轉(zhuǎn)位(translocation)延伸過程所需蛋白因子稱為延長(zhǎng)因子(elongation factor, EF)原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)EF-G真核生物：eEF-1 、eEF-2 原核延長(zhǎng)因子生物功能對(duì)應(yīng)真核延長(zhǎng)因子EF-Tu促進(jìn)氨基酰-tRNA進(jìn)入A位，結(jié)合分解GTPEF-1-EF-Ts調(diào)節(jié)亞基EF-

35、1-EF-G有轉(zhuǎn)位酶活性，促進(jìn)mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促進(jìn)卸載tRNA釋放EF-2肽鏈合成的延長(zhǎng)因子 又稱注冊(cè)(registration)（一）進(jìn)位指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。 （二）成肽是由轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase)催化的肽鍵形成過程。自動(dòng)催化過程50S（三）轉(zhuǎn)位延長(zhǎng)因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶( translocase )活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進(jìn)核蛋白體向mRNA的3側(cè)移動(dòng) 。fMetAUG53fMetTuGTP進(jìn)位轉(zhuǎn)位成肽 三、肽鏈合成的終止當(dāng)mRNA上終止密碼出現(xiàn)后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋

36、出，mRNA、核蛋白體等分離，這些過程稱為肽鏈合成終止。 終止相關(guān)的蛋白因子稱為釋放因子(release factor, RF) 一是識(shí)別終止密碼，如RF-1特異識(shí)別UAA、UAG；而RF-2可識(shí)別UAA、UGA。二是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)轷ッ富钚裕闺逆湉暮说鞍左w上釋放。 釋放因子的功能:原核生物釋放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物釋放因子：eRF1, eRF3 原核肽鏈合成終止過程 UAG53RFCOO-多聚核蛋白體(polysome)使蛋白質(zhì)合成高速、高效進(jìn)行。電鏡下的多聚核蛋白體現(xiàn)象大腸桿菌蛋白質(zhì)合成所需可溶性蛋白因子蛋白質(zhì)合成后加工和輸送Posttranslational Pro

37、cessing & Protein Transportation主要包括一、多肽鏈折疊為天然三維結(jié)構(gòu) 二、肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾三、空間結(jié)構(gòu)的修飾 四、蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送一、多肽鏈折疊為天然功能構(gòu)象蛋白質(zhì)新生肽鏈N端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開始。 一般認(rèn)為，多肽鏈自身氨基酸順序儲(chǔ)存著蛋白質(zhì)折疊的信息，即一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)。促進(jìn)蛋白折疊功能的大分子:1. 分子伴侶 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶 (protein disulfide isomerase, PDI)3. 肽-脯氨酰順反異構(gòu)酶 (peptide prolyl cis-trans iso

38、merase, PPI)Hsp70Hsp90二、一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾（一）肽鏈N端的修飾（fMet，Signal peptide）（二）個(gè)別氨基酸的修飾(Ser, Thr, Tyr)（三）多肽鏈的水解修飾（四）側(cè)鏈糖基化三、空間結(jié)構(gòu)的修飾（一）亞基聚合 （二）輔基連接（三）疏水脂鏈的共價(jià)連接 蛋白質(zhì)合成后經(jīng)過復(fù)雜機(jī)制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細(xì)胞靶部位的過程稱為蛋白質(zhì)的靶向輸送。 四、蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送蛋白質(zhì)的靶向輸送(protein targeting)所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號(hào)，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位，這一序列稱為信號(hào)序列 。 信號(hào)序列

39、(signal sequence)一、蛋白質(zhì)生物合成體系翻譯模板mRNA及遺傳密碼核蛋白體tRNA與氨基酸的活化二、 蛋白質(zhì)生物合成過程肽鏈合成的起始1. 核蛋白體大小亞基分離2. mRNA在小亞基定位結(jié)合3. 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合 4. 核蛋白體大亞基結(jié)合總 結(jié)肽鏈合成的延長(zhǎng)進(jìn)位成肽轉(zhuǎn)位肽鏈合成的終止多肽鏈折疊為天然三維結(jié)構(gòu) 肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾空間結(jié)構(gòu)的修飾 蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送三、 蛋白質(zhì)合成后加工和輸送第四節(jié) 基因突變與DNA損傷修復(fù)要點(diǎn)： 1.基因突變的相關(guān)概念、類型 2.基因突變的機(jī)制 3.基因突變的修復(fù)機(jī)制基因突變（gene mutation）:基因內(nèi)部某些位點(diǎn)的堿基發(fā)生改

40、變或堿基序列順序發(fā)生變化，乘坐基因突變。僅涉及DNA分子中單個(gè)堿基的改變稱做點(diǎn)突變（point mutation）。涉及多個(gè)堿基的還有缺失、重復(fù)和插入。突變體(mutant)：具有突變表型的細(xì)胞或個(gè)體。一、基因突變的概念、類別及性質(zhì) 概念： 從突變的表型: 1）形態(tài)突變：突變影響生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 2）生化突變：突變影響生物的代謝過程，導(dǎo)致一個(gè)特定生化功能的改變或喪失。 3）致死突變：突變影響生物個(gè)體的生活力。分為顯性致死和隱性致死。 4）條件致死突變：在某一些條件下致死，而在另一些條件下成活的突變。（2）突變類型 從對(duì)遺傳信息的改變: 1）同義突變:堿基序列的改變沒有引起產(chǎn)物氨基酸序列的改變,

41、與密碼子的簡(jiǎn)并性有關(guān)。2）無義突變:某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子，使蛋白質(zhì)合成提前終止，因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般是沒有活性的。3）錯(cuò)義突變: 堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變。 有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)活性甚至完全無活性，從而影響了表現(xiàn)型。如果該基因是必須基因，則稱為致死突變。 有些錯(cuò)義突變的產(chǎn)物仍有部分活性，使表型介于野生型與突變型之間的中間類型，稱為滲漏突變。 有些錯(cuò)義突變不影響或基本上不影響蛋白質(zhì)的活性，不表現(xiàn)明顯的性狀變化，稱為中性突變。隨機(jī)性：可發(fā)生在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中。 生殖細(xì)胞的突變頻率高于體細(xì)胞。體細(xì)胞突變?cè)陲@性或純合狀態(tài)才能表現(xiàn)，出現(xiàn)嵌合體。稀有

42、性 ：突變率是很低的。 高等動(dòng)植物10-510-8，細(xì)菌10-410-10，反應(yīng)了物種的基因的相對(duì)穩(wěn)定性。（3）突變的性質(zhì)可逆性1) 野生型基因 突變型。 2) 回復(fù)突變率一般低于正突變率。3) 真正的回復(fù)突變很少發(fā)生。常被第二個(gè)位點(diǎn)的突變所抑制，抑制因子突變（suppressor mutation）。4)回復(fù)突變的有無是區(qū)別基因突變與染色體缺失或重復(fù)的標(biāo)志。 正突變回復(fù)突變 突變的多方向性和復(fù)等位基因 同一基因可突變?yōu)槎鄠€(gè)等位基因。突變的基因可以再突變。這一系列的等位基因就叫做復(fù)等位基因。這是由于同一座位內(nèi)的不同位點(diǎn)上的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化產(chǎn)生的。 突變的有害性和有利性。 一般，有害突變多，有利突變

43、少。 物理因素： 如紫外線 化學(xué)因素烷化劑：硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯堿基類似物：5-Br UT轉(zhuǎn)換亞硝酸鹽：使A、C、G脫氨黃曲霉素：苯并必插入、移碼突變的因素 生物因素噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV, HBV）轉(zhuǎn)座子DNA受到大劑量紫外線照射時(shí)，形成二聚體紫外線可引起DNA的交聯(lián), DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)。染料分子的摻入誘導(dǎo)的基因突變常見的DNA損傷及其修復(fù)機(jī)制 DNA損傷因素 DNA損傷類型修復(fù)機(jī)制X射線、氧自由基、烷化劑 自發(fā)脫堿基單鏈斷裂、無堿基位點(diǎn)、氧化性堿基（如8-氧鳥嘌呤）脲嘧啶堿基切除修復(fù)紫外線和多環(huán)芳烴環(huán)丁烷嘧啶二聚體等大的紫外線光產(chǎn)物和穩(wěn)定的多環(huán)芳烴化合物等大分子DNA加合物核苷

44、酸切除修復(fù)抗癌藥（如順鉑和絲裂霉素）雙鏈斷裂和鏈間交聯(lián)雙鏈斷裂修復(fù)（同源重組修復(fù)和末端連接）復(fù)制錯(cuò)誤和烷化劑堿基錯(cuò)配和缺失（插入）錯(cuò)配修復(fù)（1）DNA斷裂口直接修復(fù)：在 DNA 5-P 端和 3-OH端未受損害的情況下，連接酶能夠直接修復(fù)DNA的斷裂口。（2）DNA紫外線損傷的光復(fù)合酶直接修復(fù)（3） 烷基化堿基的直接修復(fù)在大腸桿菌中的Ada酶，可修復(fù)甲基化的堿基和甲基化的磷酸二酯鍵。 堿基切除修復(fù)指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物作用產(chǎn)生 的DNA堿基損傷, 是切除修復(fù)的一種。受損堿基移除是由多個(gè)酶來完成的。主要針對(duì)DNA單鏈斷裂和小的堿基改變 及氧化性損傷。DNA切除修復(fù)機(jī)制（5）SOS 修復(fù) DN

45、A復(fù)制不很嚴(yán)格，新合成的DNA容易造成錯(cuò)誤產(chǎn)生突變。SOS修復(fù)過程及機(jī)制 基因工程簡(jiǎn)介 二十世紀(jì)五十年代Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，60-70年代Monod和Jacob提出操縱子學(xué)說，兩者相輔相承地從分子水平上揭開了遺傳密碼的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、突變、調(diào)節(jié)與控制的奧秘，使人們對(duì)生命基本現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)大大地具體化和深入，這些堪稱化時(shí)代的成就為基因工程的研究奠定了基礎(chǔ)。 基因工程(又稱重組DNA技術(shù))：其含義是用酶學(xué)方法，將異源基因與載體DNA在體外進(jìn)行重組，將形成的重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使異源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，從而改造生物特性，大量生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)物的高新技術(shù)。 僅有中心

46、法則和操縱子學(xué)說，人們還無法自如地操作基因以及隨心所欲地搬動(dòng)和改變基因。人類實(shí)現(xiàn)這一理想的時(shí)代的到來是在內(nèi)切酶、載體質(zhì)粒、連接酶以及其他修飾酶的發(fā)現(xiàn)之后。一、基因工程的工具酶和載體 1、工具酶 70年代初期，DNA限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)。許多細(xì)菌都能產(chǎn)生限制酶，但種類不同?，F(xiàn)已知的限制酶有數(shù)百種。 它們的共同特點(diǎn)是：專一性識(shí)別DNA雙鏈中的一段回文序列，在DNA鏈內(nèi)(而不是末端)切端雙鏈。切開的方式又分為兩種：(1) 主要的一種是切成粘性末端。如EcoR 可把專一性的序列5 GAATTC 33 CTTAAG5切成5 G AATTC3 3CTTAA G5 在DNA重組時(shí)，一些不同來源的、具有相同粘性末端的DNA片段可借助于堿基配對(duì)規(guī)律，重新連接和組合起來。(2)切成平齊末端。這些酶同樣具有專一性的識(shí)別順序，如：Has可把專一性的順序：5 GGCC 3切成：5 GG CC 33 CCGG 5 3CC GG5即切開之后產(chǎn)生平末端，而無單鏈末端。這樣的末端相遇時(shí)，在連接酶的作用下仍然可以再連接起來，但連接效率比粘性末端低的多。 就基因工程來講，DNA限制性內(nèi)切酶等一類酶通稱為工具酶，它是基因工程研究的技術(shù)工