生化物質(zhì)的制備和分離純化技術(shù)

1、生化物質(zhì)的制備和分離純化技術(shù)思考題（課前設(shè)疑）1.如何保持生化物質(zhì)的生物活性？一般生化物質(zhì)在堿性條件下容易變性，還是在酸性條件下容易變性？3.在制備生化物質(zhì)前應(yīng)如何選擇原料？ 5.對(duì)酸性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？對(duì)堿性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？對(duì)兩性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？6.以細(xì)丙為例解釋提取制備每步的基本原理？4.什么叫動(dòng)態(tài)吸附和靜態(tài)吸附？它們?cè)趹?yīng)用上有何區(qū)別？ 一般從天然生物材料制作生化物質(zhì)的過(guò)程大體可分為六個(gè)階段： 1.原料的選擇和預(yù)處理 2.原料的粉碎； 3.提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品 的工藝過(guò)程； 4.純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、

2、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過(guò)程； 利用生化制備技術(shù)從生物材料中獲得特殊的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸等生化產(chǎn)品時(shí)，通常要注意以下幾個(gè)問(wèn)題： 6.成品及.制劑，即半成品或原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應(yīng)用的各種劑型。5.干燥及保存；1生物材料的組成成分非常復(fù)雜，有數(shù)百種甚至更多，各種化合物的形狀、大小、相對(duì)分子質(zhì)量和理化性質(zhì)都各不相同，有的迄今還是未知物，而且這些化合物在分離時(shí)仍在不斷的代謝變化中。 2在生物材料中，有些化合物含量很低或極微，有的只有1l0 000，甚至更少。制備時(shí)，原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少，與投料量相比“虎頭

3、蛇尾”。近年來(lái)，用所謂“釣魚(yú)法”，利用某些分子特有的專(zhuān)一親和力，將某一化合物從極復(fù)雜的體系中“釣”出來(lái)，與其他化學(xué)分離技術(shù)相比具有很大的優(yōu)越性。 3許多生物活性物質(zhì)，一旦離開(kāi)了生物體內(nèi)環(huán)境，很易變性及被破壞，應(yīng)十分注意保護(hù)這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)制備的操作時(shí)間長(zhǎng)、手續(xù)較繁瑣。因?yàn)樵S多大分子在分離過(guò)程中，過(guò)酸、過(guò)堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機(jī)械作用、強(qiáng)烈的輻射和機(jī)體內(nèi)自身酶的作用，均可破壞這些分子的結(jié)構(gòu)或生理活性。 4生化分離制備過(guò)程幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種溫度、pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)，對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，常常無(wú)法固定，有些實(shí)驗(yàn)

4、或工藝的設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)，常帶有很大的經(jīng)驗(yàn)成分。因此，要建立重復(fù)性好的成熟工藝，對(duì)生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴(yán)格地加以規(guī)定。 5生化制備方法最后均一性的證明與化學(xué)上純度的概念并不完全相同，這是由于生物分子對(duì)環(huán)境反應(yīng)十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系比較復(fù)雜，評(píng)定其均一性時(shí)，要通過(guò)不同角度測(cè)定，才能得出相對(duì)“均一性”結(jié)論，只憑一種方法所得純度的結(jié)論，往往是片面的，甚至是錯(cuò)誤的。原料選擇和預(yù)處理 選什么樣的原材料應(yīng)視生產(chǎn)目的而定。一般要注意以下幾個(gè)方面: 1要選擇有效成分含量高的新鮮材料； 2來(lái)源豐富易得； 3制造工藝簡(jiǎn)單易行； 4成本比較低； 5經(jīng)濟(jì)效果要好。 如蛋白質(zhì)原料的選擇 蛋白質(zhì)類(lèi)生化產(chǎn)

5、品的原料來(lái)源有動(dòng)植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的、易于獲得和易于提取的無(wú)害生物材料。 對(duì)天然蛋白質(zhì)生化產(chǎn)品，為提高其質(zhì)量、產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，對(duì)原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來(lái)源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。 1種屬 牛胰含胰島素（isulin)單位比豬胰高，牛為4000 IUkg胰臟，豬為3000 IUkg胰臟?？乖詣t豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有1個(gè)氨基酸的差異，而牛有3個(gè)氨基酸的差異。 2發(fā)育生長(zhǎng)階段 幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動(dòng)物

6、。 3生物狀態(tài) 動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對(duì)提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對(duì)膽汁的收集不利。嚴(yán)重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細(xì)胞生成素）含量增加。 4原料來(lái)源 血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無(wú)二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來(lái)源為好，因其不含蛋白水解酶。 5原料解剖學(xué)部位 豬胰臟中，胰尾部分含激素較多，而胰頭部分含消化酶較多。如分別摘取則可提高各產(chǎn)品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶(pepsin)則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。 6.從簡(jiǎn)化提純步驟著手 如從鴿肝中提取乙酰化酶，需將

7、動(dòng)物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡(jiǎn)化純化步驟。7對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求 選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)胞也應(yīng)考慮到后處理的問(wèn)題。如用大腸桿菌表達(dá)，由于其不能將所表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到體外，故提取時(shí)必須破壁，增加了提取的困難，而且還可能含有毒素類(lèi)有害因子；用枯草桿菌 用腫瘤細(xì)胞作宿主細(xì)胞制成的生化產(chǎn)品還應(yīng)考慮到其安全性，制造體外診斷用試劑則是很好的高產(chǎn)方法?；蚪湍妇魉拗骶m可解決這一矛盾，但表達(dá)的蛋白質(zhì)成分仍有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷；用動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)則能比較好地解決后處理及完整表達(dá)的問(wèn)題。原料的粉碎 在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適用的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)生物

8、活性物質(zhì)充分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動(dòng)物的臟器組織，常用絞肉機(jī)機(jī)械法粉碎；植物肉質(zhì)組織可以磨碎；許多微生物均具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。如果提取的有效成分是體液或細(xì)菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細(xì)胞。 主要通過(guò)機(jī)械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時(shí)，可使用高速組織搗碎機(jī)（10 000rmin）、勻漿器、研缽、研船等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬(wàn)能粉碎機(jī)、絞肉機(jī)、擊碎機(jī)等。 一、機(jī)械法 二、物理法1.反復(fù)凍融法 把待破碎的樣品冷至1

9、520，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分動(dòng)物性的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。 在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。操作時(shí)，將材料投入沸水中，在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。 2.冷熱交替法 3超聲波處理法 多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶時(shí)，常用50100mgL菌體的濃度，在1KHz10KHz（千赫茲）頻率下處理1015min。對(duì)于其他細(xì)菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對(duì)超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。 4.壓破碎法 加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產(chǎn)的高壓勻

10、質(zhì)機(jī)），達(dá)34.32（兆帕）MPa（210350kgfcm2）的壓力時(shí)，可使90%以上細(xì)胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。 三、生化及化學(xué)法 1自溶法 即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)的方法。自溶的溫度，動(dòng)物材料選在04，微生物材料則多在室溫下進(jìn)行。 自溶時(shí)，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細(xì)菌的污染。因自溶的時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質(zhì)時(shí)比較少用。2酶處理法 用外來(lái)酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專(zhuān)一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造DNA時(shí)，采用pH8

11、的L三羥甲基氨基甲烷（Tris）L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保溫10min，細(xì)菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細(xì)胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專(zhuān)一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。 3.表面活性劑處理法 表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。 生化物質(zhì)的提取 利用一種溶劑對(duì)不同物質(zhì)溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過(guò)程稱(chēng)為提?。╡xtrac

12、tion），提取又稱(chēng)萃取或抽提，其含義基本相同。用冷溶劑從固體物質(zhì)提取的過(guò)程可稱(chēng)為浸漬（maceration）；用熱溶劑者可稱(chēng)為浸提（digestion），也稱(chēng)浸煮 一、物質(zhì)的性質(zhì)與提?。ㄒ唬┪镔|(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇 選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。 （二）活性物質(zhì)的保護(hù)措施 1采用緩沖系統(tǒng) 2添加保護(hù)劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等） 3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4其他保護(hù)措施(避免過(guò)酸過(guò)堿和劇烈攪拌 ）（三）生化物質(zhì)的提取 一般生產(chǎn)上多用23次提取。溶劑用量（L）為生物材料的25倍，少數(shù)情況也有用1020倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時(shí)間，降低有害酶的作用。 二、影響提取的

13、因素 （）溫度（二）酸堿度 （三）鹽濃度 四、提取方法 （）用酸、堿、鹽水溶液提?。ǘ┯帽砻婊钚詣┨崛。ㄈ┯袡C(jī)溶劑提取 對(duì)酸性物質(zhì)的提取，常在堿性條件下進(jìn)行；對(duì)堿性物質(zhì)的提取，常在酸性條件下進(jìn)行；對(duì)兩性物質(zhì)的提取，則使水溶液的pH值在該兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)附近為佳。三、超臨界氣體的萃取技術(shù) 以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超過(guò)臨界溫度和臨界壓力時(shí)，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質(zhì)。 氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學(xué)穩(wěn)定性好，價(jià)廉易得等特點(diǎn)。主要有二氧化碳、氮?dú)?、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧?/p>

14、碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。 該技術(shù)應(yīng)用于酶、不飽和脂肪酸的提?。ㄈ玺~(yú)油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化產(chǎn)品的溶劑脫除。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時(shí)間。 五、提取液的分離 提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一股處理方法有三種：自然沉降、過(guò)濾、離心。自然沉降是在液體介質(zhì)中，固體自然下沉而分離的過(guò)程。當(dāng)混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時(shí)，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分

15、移去。過(guò)濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體 通過(guò)，達(dá)到固體與液體分離的過(guò)程。離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力進(jìn)行分離物料的一種操作，其中通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)分離液體和固體者為離心過(guò)濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進(jìn)行沉降分離者為離心沉降。生化物質(zhì)的分離純化技術(shù) 生化物質(zhì)分離純化技術(shù)包括：生化產(chǎn)品的分離分析和生化產(chǎn)品的制備。前者主要對(duì)生物體內(nèi)各組份加以分離后進(jìn)行定、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來(lái)；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。 為了保護(hù)目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物產(chǎn)品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進(jìn)行，即常

16、說(shuō)的“逐級(jí)分離”方法。為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)合幾個(gè)，甚至十幾個(gè)步驟，并不斷變換各種不同類(lèi)型的分離方法，才能達(dá)到目的。因此操的時(shí)間長(zhǎng)，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來(lái)眾多影響。親和層析法具有從復(fù)雜生物組成中專(zhuān)一的“釣出”特異生化成分的特點(diǎn)，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應(yīng)用。一 分離純化原理 （1）根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離。如差速離心與超離心，膜分離（透析、 電滲析）與超濾法，凝膠過(guò)濾法。 （2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進(jìn)行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。 （3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，

17、等電點(diǎn)沉淀法及有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。 （5）根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離親和層析法。二 分離純化的程序和生產(chǎn)設(shè)計(jì)（1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)；（3）材料處理及抽提方法的選擇； （4）分離純化方法的摸索； （5）產(chǎn)物的均一性測(cè)定。 1分離純化初期使用方法的選擇 早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負(fù)荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進(jìn)一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大者為合適，但

18、隨著許多新技術(shù)的建立，一個(gè)特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡(jiǎn)化，收率愈高，生化物質(zhì)的變性危險(xiǎn)愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動(dòng)電泳、連續(xù)流動(dòng)等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。2各種分離純化方法的使用程序 生化物質(zhì)的分離都是在液相中進(jìn)行，故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎(chǔ)。 例如純化其一兩性物質(zhì)時(shí)，前一步已利用該物質(zhì)的陰離子性質(zhì)，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時(shí)再應(yīng)用其陽(yáng)離子性質(zhì)作層析或電泳分離便會(huì)取得較好分離效果。 如有些雜質(zhì)在各種條件下帶電荷性質(zhì)可能與目的物相似，其分子形

19、狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質(zhì)的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質(zhì)不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心或膜過(guò)濾法除去分子量相差較大的雜質(zhì)，然后在一定pH值和離子強(qiáng)度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進(jìn)行色層析分離。 在安排純化方法順序時(shí)，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會(huì)因離子過(guò)多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復(fù)雜化。如倒過(guò)來(lái)進(jìn)行，先吸附，后鹽析就比較合理。 3分離后期的保護(hù)性措施 在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過(guò)程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無(wú)法了解的

20、因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時(shí)常加入一些電解質(zhì)以保護(hù)生化物質(zhì)的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。三 分離純化方法的評(píng)估 每一個(gè)分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質(zhì)時(shí)，回收率的高低十分重要。一般經(jīng)過(guò)56步提純后，活力回收在25以上。但不同物質(zhì)的穩(wěn)定性不同、分離難易不同，回收率也不同。 對(duì)每一步驟方法的優(yōu)劣的記錄，體現(xiàn)在所得產(chǎn)品重量及活性平衡關(guān)系上。這一關(guān)系，可通過(guò)每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產(chǎn)物重

21、量與活性關(guān)系，通過(guò)測(cè)定酶的比活力及溶液中蛋白質(zhì)濃度的比例。其他活性物質(zhì)也可通過(guò)測(cè)定總活性的變化與樣品重量或體積與測(cè)出的活力列表進(jìn)行對(duì)比分析，算出每步的提純倍數(shù)及回收率。 四 生化產(chǎn)品純度的鑒定 一個(gè)制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評(píng)價(jià)常須經(jīng)過(guò)數(shù)種方法的驗(yàn)證才能肯定。有時(shí)某一種測(cè)定方法認(rèn)為該物質(zhì)是均一的，但另一種測(cè)定方法卻可把它分成兩個(gè)甚至更多的組分，這就說(shuō)明前一種鑒定方法所得的結(jié)果是片面的。如果某物質(zhì)所具有的物理、化學(xué)等方面性質(zhì)經(jīng)過(guò)幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認(rèn)為它是均一的。當(dāng)然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)還可能發(fā)現(xiàn)它

22、不是均一的。絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)只有把制備物的全部結(jié)構(gòu)搞清楚，并經(jīng)過(guò)人工合成證明具有相同生理活性時(shí)，才能肯定制備物是絕對(duì)純凈的。 生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學(xué)組成分析法，電泳法，免疫學(xué)方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測(cè)定法，以及質(zhì)譜法等。細(xì)胞色素C的制備與測(cè)定 細(xì)胞色素C的性質(zhì) 細(xì)胞色素（Cytochrome）是包括多種能夠傳遞電子或能夠激活氧的含鐵蛋白質(zhì)的總稱(chēng)，廣泛存在于自然界，在各種動(dòng)物，植物組織和微生物中都能找到。在生物氧化過(guò)程中，細(xì)胞色素是重要的呼吸傳遞體。細(xì)胞色素C（Cytochrome C）又稱(chēng)細(xì)胞色素丙，簡(jiǎn)稱(chēng)細(xì)丙。主要存在于線粒體中，需氧多的組織含細(xì)胞色素C

23、最多，如心肌及酵母細(xì)胞的細(xì)胞色素C含量比一般組織細(xì)胞的高。所以制備中多采用心肌和酵母作為提取分離細(xì)胞色素C的原料。 細(xì)胞色素C是含鐵卟啉的結(jié)合蛋白質(zhì)。鐵卟啉和蛋白質(zhì)部分的比例為1:1。由碳、氫、氧、氮、硫、鐵6種元素組成。牛、馬、豬、人心的細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)部分均由104個(gè)氨基酸組成，其中只有數(shù)個(gè)氨基酸不同，氨基酸中含有較多的精氨酸，故呈鹽基性。豬心肌的細(xì)胞色素C含鐵量為 ，相對(duì)分子質(zhì)量12200，等電點(diǎn)pI為。細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)中的輔基通過(guò)卟啉環(huán)上乙烯基的-碳和酶蛋白的一SH基按1:1連接成硫醚鍵，其連接方式見(jiàn)下圖。 圖 細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)式 細(xì)胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它

24、可分為氧化型和還原型兩種。細(xì)胞色素C的傳遞電子作用是由于細(xì)胞色素C中的鐵原子可以進(jìn)行可逆的氧化和還原反應(yīng)。 R 一Fe3+ RFe2+ 氧化型細(xì)胞色素C 還原型細(xì)胞色素C 這里R代表細(xì)胞色素C分子中鐵原子以外的卟啉蛋白部分。從以上反應(yīng)式可見(jiàn)，當(dāng)細(xì)胞色素C分子中的鐵原子為三價(jià)時(shí)(Fe3十)，是氧化型的，但接受一個(gè)電子后變成二價(jià)鐵（Fe2+），成了還原型的細(xì)胞色素c分子，電子一旦給出后又成了氧化型的。兩者在水溶液中的顏色明顯不同：其氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對(duì)熱較穩(wěn)定，不易變性，在時(shí)，加熱至100 3min，變性才1828%。對(duì)酸堿比較穩(wěn)定，可抵抗L HCl和的長(zhǎng)時(shí)間處

25、理。但三氯醋酸和乙酸可使之變性，引起某些失活。其還原型較氧化型穩(wěn)定，不易與一氧化碳（CO）、氰化鉀（KCN）結(jié)合，故一般都制成還原型，比較穩(wěn)定，易保存細(xì)胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低溫保存，亦可保存于硫酸銨溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成凍干粉末，可保持活性數(shù)年。細(xì)胞色素C的臨床作用 細(xì)胞色素C是一種細(xì)胞呼吸激活劑。在臨床上細(xì)胞呼吸障礙引起的一系列缺氧狀態(tài)，在使用細(xì)胞色素C后就可以糾正其物質(zhì)的代謝，使細(xì)胞恢復(fù)正常呼吸，病情得到緩解或痊愈。細(xì)胞色素C目前在臨床上雖非特效藥物，但可用于缺氧急救、解毒及其輔助治療，是治療組織缺氧及由缺氧所引起的一系列癥狀的重要生物藥品。如用細(xì)胞色素C治療腦血管障礙、腦軟化、腦出血、中風(fēng)后遺癥、腦動(dòng)脈硬化癥、腦外傷、嬰幼兒百日咳、腦病、不可逆休克期缺氧、腦栓塞、腦震蕩后遺癥、乙型腦炎的神經(jīng)精神癥狀、心代償不全、心肌炎、狹心癥、白喉心肌炎、肺心病、心絞痛、心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺氣腫及支氣管擴(kuò)張引起的呼吸困難、一氧化碳中