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文檔簡介

1、NF-B圈套核苷酸-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備及評(píng)價(jià)胡娟,羅艷(400016重慶,重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科)摘要 目的 制備NF-B圈套核苷酸(decoy ODNs)-聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)納米粒(NF-B decoy ODNs-PBCA-NP)。方法 用DEAE-Dextran作為穩(wěn)定劑,通過乳液聚合法制備帶正電荷的PBCA-NP運(yùn)載NF-B decoy ODNs,檢測(cè)其形態(tài)、粒徑、負(fù)載率、物理穩(wěn)定性及細(xì)胞毒性。結(jié)果 制備的納米粒大小均勻,空白納米粒平均粒徑為70 nm,zeta電位為+21.6 mV,負(fù)載率為97.49,復(fù)合納米粒平均粒徑為150 nm,在150 ng/l

2、以下濃度幾乎觀察不到細(xì)胞毒性。結(jié)論 該方法制備了負(fù)載率高、大小均勻的、細(xì)胞毒性小的NF-B decoy ODNs-PBCA納米粒。關(guān)鍵詞 NF -B圈套;聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒;乳液聚合法中圖法分類號(hào) R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A _基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金(30271267)通信作者羅艷,電話:(023)89012211,E-mail:核因子-B(NF-B)是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,它與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)1,被認(rèn)為是這些疾病的新型治療靶點(diǎn)。NF-B圈套策略(NF-B decoy strategy)是采用人工合成的高親合力寡核苷酸(oligonucleotide,ODNs)作為圈套來轉(zhuǎn)染細(xì)胞

3、,競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,從而抑制內(nèi)源性基因表達(dá)2,3。但ODNs細(xì)胞膜通透性差,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量少,且易被核酸酶降解。本研究以氰基丙烯酸正丁酯(BCA)為原料,陽離子復(fù)合物二乙胺基乙基(diethylaminoethyl) -葡聚糖(DEAE- dextran)做穩(wěn)定劑,用乳液聚合法制備了PBCA-NP,以decoy ODNs為模型基因制備出核因子-B圈套核苷酸-聚氰基丙烯酸正丁酯-納米粒(NF-B decoy ODNs -PBCA-NP),研究其負(fù)載率、耐酶解能力、細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力,希望為基因治療和基因調(diào)控提供新的手段。1 材料與方法 11 主要材料 BCA(浙江金鵬化工股份有限公司),D

4、EAE-Dextran500000(Sigma公司),Dextran6000(Sigma公司), Zetasizer4700(英國馬爾文公司),熒光顯微鏡(日本Olympus),凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad),透射電子顯微鏡HITACHI-600(日本日立)。12 NF-B decoy ODNs的合成 NF-B decoy ODNs單鏈(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)序列為:5-pCGGAAAGTCCCTTTTTTTTAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCTTTTTTTGGAAAGTCCCCAG-3。將ODN單鏈溶解于SSC溶液中,經(jīng)過退火、復(fù)性得到decoy ODNs

5、。 13 DEAE-PBCA納米粒的制備 取30ml蒸餾水,用HCl調(diào)節(jié)至pH為2,將DEAE-dextran0.12g、Dextran0.18g加入,待溶解后,將0.3gBCA單體緩慢加入,用NaOH調(diào)節(jié)H值至6,再攪拌1 h即可。14 NF-B decoy ODNs-DEAE-PBCA復(fù)合納米粒制備 將ODNs與NP分別溶解在等體積的培養(yǎng)液中,再將兩者充分混合,室溫靜置30 min即可。15 納米粒的形態(tài)學(xué)觀察及電位測(cè)定將制成的納米粒取少量稀釋,滴至銅網(wǎng)上,鎢酸染色后在透射電鏡下觀察;另取少量加雙蒸水稀釋后用納米粒度儀測(cè)定電位。16 負(fù)載率測(cè)定制得的納米粒離心后取上清液稀釋,用紫外分光光度

6、計(jì)測(cè)量光密度值。附:負(fù)載率=(C0-C)/ C0100% (C0為投入ONDs量,C為上清液中的ODNs量) 17 物理穩(wěn)定性及體外耐酶解實(shí)驗(yàn)1.7.1物理穩(wěn)定性考察 將PBCA-NP懸液密封,一段時(shí)間后觀察。另取NP分別加入不同介質(zhì)中,觀察是否出現(xiàn)凝集。1.7.2體外耐酶解實(shí)驗(yàn) 將復(fù)合納米粒加入磷酸二酯酶溶液中,同時(shí)以不含NP的decoy ODNs作為對(duì)照,于700 r/min分別振蕩1、4、8、16 h后各管加入NaOH,放置12 h后進(jìn)行凝膠電泳分析。18 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 接種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)為1104 /孔,于5%CO2,37孵箱中培養(yǎng)24 h,用PBS沖洗細(xì)胞2次。加入培養(yǎng)液及不同濃

7、度的納米粒(每組3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照),培養(yǎng)6 h后棄上清液,加入培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。19 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 接種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)為5104/孔,培養(yǎng)24h后用PBS沖洗2次。將PBCA-NPs同熒光標(biāo)記的decoy ODNs、Tween80混勻;往各培養(yǎng)孔加入配置好的復(fù)合物,分別在30 min、6 h、12 h、24 h收集長有細(xì)胞的玻片,熒光顯微鏡檢測(cè)。2 結(jié)果21 納米粒形態(tài)及zeta電位PBCA-NP和載decoy ODNs的NP呈表面圓形(圖1、2),大小較均勻,粒子包封完整;經(jīng)測(cè)量空白納米粒的粒徑為70 nm,復(fù)合納米粒的粒徑為150nm。納米粒度儀測(cè)得

8、PBCA-NP zeta電位為21.6 mV,說明該納米粒表面帶有正電荷。 圖1空白NP透射電鏡觀察 圖2復(fù)合NP透射電鏡觀察(50 000) (100 000)22 負(fù)載率測(cè)定當(dāng)反應(yīng)pH值為2和7時(shí),納米粒的負(fù)載率較高;因細(xì)胞生存條件接近中性,故將后續(xù)反應(yīng)pH值定為7;而decoy/PBCA質(zhì)量比為1:10,納米粒負(fù)載率較高,達(dá)97.49。23 納米粒的物理穩(wěn)定性及體外耐酶解實(shí)驗(yàn)2.3.1 物理穩(wěn)定性考察 PBCA-NP放置加入各種介質(zhì)之后,我們觀察到:加入PBS緩沖液及Tris-HCl緩沖液的納米粒發(fā)生了顯著的凝集;加入DMEM培養(yǎng)液的納米粒有輕微凝集;加入含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)液及生

9、理鹽水的納米粒未見凝集。封存的納米粒放置3個(gè)月后,瓶底有少許沉淀,水浴超聲后顆粒能重新分散,粒徑無明顯變化。2.3.2體外耐酶解實(shí)驗(yàn) 凝膠電泳顯示PBCA-NP結(jié)合的decoy ODNs即使被磷酸二酯酶消化了16 h仍能保持結(jié)構(gòu)的完整,而裸decoy ODNs在同樣條件下1 h已被降解。24 納米粒的細(xì)胞毒性我們以不同濃度發(fā)納米粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),只有在150 ng/l的較高濃度才觀察到細(xì)胞毒性。25 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)制得的納米粒能有效的轉(zhuǎn)染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。0.5 h后在細(xì)胞內(nèi)即可觀察到綠色熒光,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間增加,熒光逐漸增多,68 h達(dá)到高峰。熒光信號(hào)開始主要分布在細(xì)胞外及細(xì)

10、胞漿內(nèi),隨后逐漸進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。圖3 熒光標(biāo)記的ODNs轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮細(xì)胞6 h(熒光顯微鏡)3 討論近年來,非病毒納米載體以其轉(zhuǎn)染效率高、安全低毒、無免疫原性的特點(diǎn)引起越來越多的關(guān)注。本研究選用的PBCA納米粒對(duì)細(xì)胞無毒性、可提高細(xì)胞對(duì)寡核苷酸攝入率4,且經(jīng)表面活性劑修飾后可攜帶藥物透過血腦屏障5,可作為許多藥物的腦靶向載體6,7。由于ODNs與PBCA均具有陰離子特性,二者之間難以吸附,故需加入陽離子復(fù)合物形成帶正電荷的納米粒,以促進(jìn)兩者結(jié)合。制備陽離子納米粒時(shí)常用的陽離子聚合物有CTAB和DEAE-dextran,但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DEAE-dextran所修飾的載ODNs納米粒的穩(wěn)定性優(yōu)于CT

11、AB所修飾的ODNs納米粒8。DEAE-dextran以鑲嵌、吸附等方式在納米粒的表面形成一個(gè)有層次的吸附網(wǎng),通過自身的陽離子吸附上帶陰離子的ODNs,提高納米粒的負(fù)載率。通過實(shí)驗(yàn)我們?cè)俅巫C實(shí)了PBCA-NP作為基因載體的優(yōu)勢(shì):制備工藝安全、低廉、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好;制得的納米粒大小均勻,負(fù)載率高,能保護(hù)ODNs免受核酸酶的降解。在基因治療方面,展示出了廣闊而誘人的前景。參考文獻(xiàn):1 Isomura I,Morita ARegulation of NFkappa B signaling by decoy oligodeoxynucleotidesJMicrobial Immunol,20

12、06,50(8):559-5632 Fichtner-Feigl S,F(xiàn)uss LJ,Press Jc,et alTreatment of murine Th1- and Th2-mediated inflammatory bowel disease with NF- kappa B decoy oligonucleotidesJJ Chin Invest,2005,115(11):3057-30713 Wang H,Hu Y,Guo T, et alInhibition of tissue factor expression in brain microvascular endothelia

13、l cells by nanoparticles loading NF- kappaB decoy oligonucleotidesJInt J Mol Scl,2008,9(9):1851-18624 Liu W,Zhang HL,Zhou TY,etal .Study on preparation of antisense oligodeoxynucleotides-loaded polybutylcyanoacrylaten anoparticles and its loadingJ. Chin Pharm,2005,40:1312-1315.5 SI Park,JH Lim,YH Hw

14、ang,et a1In vivo and in vitro antitumor activity of doxorubicinloaded magnetic fluidsJPhys Sstat Sol,2007,12(4):4345-43516 Kuo YC,Chen HHEffect of nanoperliculate polybutylcyanoacrylate and methylmethacrylate-sulfopropylmethacrylate on the permeability of zidovudine and lamivudine across the in vitro blood-brain barrierJIm J Pharm,2006,327(1/2):1601697 Kuo YC,Su FLTransport of stavudine,dehvirdine,and saquinavir across the blood-brain barrier by polybutylcyanoacrylate,metbylmethacrylate-sulfopropylmethacr

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