4生物樣品超薄切片技術(shù)

1、常規(guī)制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)負(fù)染色技術(shù)透射電鏡特殊制樣技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡技術(shù) X射線微區(qū)分析技術(shù)1第四章 透射電鏡生物樣品 制備技術(shù)第一節(jié) 載網(wǎng)和支持膜第二節(jié) 超薄切片的制作第三節(jié) 負(fù)染色技術(shù)2第一節(jié) 載網(wǎng)和支持膜一、載網(wǎng)：用于承載樣品的(直徑為3mm)網(wǎng)狀材料。1.載網(wǎng)的類型及選擇：非金屬網(wǎng)：載網(wǎng)金屬網(wǎng)銅網(wǎng)：惰性網(wǎng)：70的透過率2.載網(wǎng)的清洗：酸堿法或有機(jī)溶劑、蒸餾水等洗凈干燥。X射線元素分析常規(guī)超薄切片(200目以上)細(xì)胞化學(xué)3二、樣品支持膜為了增強(qiáng)樣品的強(qiáng)度，在載網(wǎng)表面先覆一層薄膜。1.對膜的要求：本身沒有結(jié)構(gòu)，薄而透明，電子束易通過；有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，經(jīng)得住電子束的轟

2、擊；不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。厚度在1015nm2.常用支持膜及其制備福爾莫瓦膜（Formvar):化學(xué)名稱：聚乙烯醇縮甲醛.特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度高，制作簡便.制作：0.20.5的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剝離法。火棉膠膜：12%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。碳膜：穩(wěn)定性好，高分辨制樣。4操作方法0.20.5%的氯仿溶液蒸餾水膜1.福爾莫瓦支持膜的制作方法2.火棉膠膜用平皿水面展開法：平皿中盛有雙蒸餾水，滴兩滴13%的火棉膠膜液，待片刻溶劑揮發(fā)后，在膜上擺放潔凈的銅網(wǎng)，濾紙撈起。3.碳膜制作：用真空噴鍍法制膜。5第二節(jié) 超薄切片的制作超薄切片：是指厚度小于100 (5070)納米的切片。要求：厚薄均勻、厚度

3、符合標(biāo)準(zhǔn)； 無皺褶刀痕、震顫和沉淀； 細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存良好，具有良好的電子反差； 具有一定程度的機(jī)械強(qiáng)度。制作流程：包括六大步，40多次操作取材固定脫水包埋切片染色鏡檢6超薄切片制作流程圖04室溫2323760染色觀察聚合修塊切片撈片取材固定漂洗50%70%80%包埋90%95%100%過渡浸透7一、取材從動、植物機(jī)體上或細(xì)胞及微生物培養(yǎng)物中獲取所需要的研究材料的操作過程。1.取材的原則要求：準(zhǔn)、快、小、冷、輕五字原則。準(zhǔn)確：根據(jù)研究目的確定取材部位，取到典型部位?？焖伲翰牧想x體后應(yīng)在1分鐘內(nèi)投入固定液。體積小：固定液滲透力所限，樣品體積為1mm 或13mm長條。低溫：固定液及器材需預(yù)冷(04 )

4、，以降低自溶酶的活性。防損傷：器械要鋒利，切割輕巧，防擠壓、牽拉損傷 組織細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢82.取材方法： 動物材料的獲?。杭毙蕴幩阑蚵樽砗?，在12分鐘解剖出所需材料，切成標(biāo)準(zhǔn)塊立即投入固定液，低溫(04)保存；特殊難取的材料必須原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。 植物材料的獲?。鹤⒁獠课缓头较蛐?。葉片切取13長條；根、莖切取標(biāo)準(zhǔn)塊；表面有毛刺的材料先用酶處理使之軟化，表面有蠟質(zhì)的葉片先脫蠟，蒸餾水洗凈后再取材固定。懸浮樣品的獲取：加入適量固定液懸浮固定后，低速離心收集成團(tuán)塊再固定。需抽氣使樣品沉底保低溫 野外取材：攜帶冰壺保存固定液和材料，確保動物

5、材料的現(xiàn)場固定；植物材料可保濕帶回實(shí)驗(yàn)室再取材固定。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢9二、固定用化學(xué)或物理的方法迅速殺死細(xì)胞的過程1.固定的目的：在分子水平上真實(shí)地保存組織細(xì)胞生活狀態(tài)的細(xì)節(jié)，盡量減少細(xì)胞的死后變化。2.固定的類型：固定物理固定法：化學(xué)固定法：3.固定液的作用：迅速均勻滲透到細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定各種細(xì)胞成分；破壞細(xì)胞的酶系統(tǒng)，阻止細(xì)胞的自溶；通過化學(xué)作用建立分子交聯(lián)，形成細(xì)胞骨架；提供一定的電子反差。超低溫快速冷凍固定法使用化學(xué)試劑快速殺死細(xì)胞取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢1012.0%4.常用固定劑及其特點(diǎn) 醛類：甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛戊二醛：穿透力強(qiáng)，能

6、很好固定蛋白質(zhì)和糖元、保存核酸、核蛋白，對微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜系統(tǒng)保存較好；不能保存脂類物質(zhì)，無電子染色作用。配制方法：常用0.1M的磷酸鹽緩沖液(pH6.87.2) 配成2.05.0。選用：單細(xì)胞 微生物 動物組織 植物組織 厚壁組織濃度高5.0% 鋨酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定劑，具有電子染色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保存核酸和糖類。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢115.固定方法：(1)單固定法：用于易于滲透的材料和酶的細(xì)胞化學(xué)(2)雙固定法：戊二醛鋨酸雙重固定(3)原位固定法：用于難解剖的、對缺氧敏感的組織器官，在保持血液供應(yīng)的狀態(tài)，邊解剖邊滴加固定液，待組織適度

7、硬化后再取材作常規(guī)固定。(4)灌流固定：常用醛類固定：用于腦組織、植物葉片的氣孔狀態(tài)等通過血液循環(huán)的途徑，將固定液灌注到相應(yīng)部位，待組織適度硬化后再解剖取材，作常規(guī)固定。用于解剖關(guān)系復(fù)雜的組織（神經(jīng)組織、腦垂體）戊二醛取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢12直接影響被固定細(xì)胞的原有特定形態(tài)6.影響固定效果的因素(1)固定液的酸堿度：固定液的酸堿度必須與被固定材料的酸堿度基本一致。例如多數(shù)動物的pH值平均為7.4，所以常用PH7.27.4； 植物體的pH值為6.87.1，所以常用PH7.07.2； 原生動物及胚胎適于pH為8.08.5，胃黏膜pH為8.5 效果最佳；(2)固定液的滲透壓：固定

8、液與被固定組織之間必須保持滲透平衡。電解質(zhì)：鉀鈉鈣(0.5% CaCl)可防止膨脹非電解質(zhì)：蔗糖、葡萄糖膜系統(tǒng)穩(wěn)定劑取材固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢13（3）緩沖液類型磷酸鹽緩沖液：仿效細(xì)胞外液成分配制，無毒且富有生理功能。適于配各種固定液和材料漂洗液。二鉀胂酸鹽 緩沖液有毒，穩(wěn)定性好。適用于細(xì)胞化學(xué)和保存脂肪的樣品處理、鈣離子定位研究不宜長期保存可長期保存取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢14(4)固定時間、溫度及樣品塊大小時間：因材料而異，單細(xì)胞和動物材料較短，植物材料 及厚壁組織較長。112小時。溫度：低溫以抑制酶的活性，通常在04條件固定。樣品塊大?。菏芄潭ㄒ簼B透能力影響，

9、小塊材料易得到良好固定。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢157. 注意事項（1）控制固定溫度04利于抑制酶的活性，減少細(xì)胞 自溶。（2）掌握固定時間：根據(jù)材料類型和特點(diǎn)而定，后固定 時間不宜太長，否則易造成碎片。（3）充分漂洗：除去殘留固定液。（4）特殊材料的特殊處理：植物及較疏松的材料：抽氣使其沉入固定液中；厚壁組織：采用低壓容器或振蕩方式促進(jìn)滲透；表面有蠟質(zhì)的材料：應(yīng)該先脫蠟后固定。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢16三、脫水脫水指用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，取代組織細(xì)胞中的游離水的過程。1.必要性：水分存在會影響非水溶性包埋劑的滲透，進(jìn)而影響切片的完整性2.常用脫水劑：醇類(乙醇)

10、和丙酮3.脫水方法：梯度系列脫水法。30%50% 70% 80% 90 %95% 100%2次4.注意事項：脫水中斷只能在70%，高濃度脫水劑易使組織變脆，成分抽提；末級脫水劑應(yīng)先用吸水劑處理，以保證脫水徹底；高濃度脫水操作要快，以防樣品內(nèi)進(jìn)入空氣或吸水受潮。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢17四、浸透與包埋：用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外的所有孔隙都被包埋劑填充，聚合后形成適合機(jī)械切割的固體包埋塊。1.包埋劑：理想包埋劑的特點(diǎn)：粘稠度低，容易滲透；聚合均勻，不產(chǎn)生體積收縮；耐電子束轟擊，高溫不變形，不升華；本身無結(jié)構(gòu)，并具有良好的切割性能，切片易染色。常用包埋劑：非水溶性

11、(Epon812)和水溶性包埋劑。包埋劑 Epon812或618固化劑 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA（六甲酸酐）增塑劑 DBP（鄰苯二甲酸二丁脂）催化劑 DMP-30調(diào)節(jié)塑性而改變切割性能用于618邊脫水邊包埋取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢182.浸透四.浸透與包埋脫水后經(jīng)環(huán)氧丙烷過渡,再逐漸浸入包埋劑。包埋劑:過渡劑比例為 1 :31 :13:1純包埋劑浸透時間：因材料而異 1 :3 1 :1 3:1單細(xì)胞 0.5 0.51 0.5動物材料 1 14 12植物材料 1 112 212比例時間材料3.包埋常規(guī)包埋：用牙簽把材料挑入模具，注入包埋劑，做好標(biāo)記；定向包埋：樣品挑入

12、淺槽，擺好方向、注劑、裝標(biāo)簽；注意事項：樣品塊附近不能存在氣泡。4.聚合循序漸進(jìn)提高溫度，促進(jìn)聚合37 (12h)45(12h)60(24h)取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢19五、超薄切片制刀修塊切片展片撈片1.切片刀：鉆石刀、玻璃刀12mm25/38mm46.5mm制作玻璃刀：2.修塊：除去樣品周邊的包埋介質(zhì)和不感興趣部位，保留有用信息便于切割，提供盡可能大的有效觀察面。要點(diǎn)：上、下邊必須平行形狀：頂端面為梯形的錐體（金字塔形）取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢203.切片=厚度熱膨脹推進(jìn)式切片機(jī)示意圖裝刀、加水：特別注意刀高和傾角，液面高度；切片、撈片：切片帶用睫毛筆收集，

13、銅網(wǎng)沾取；切片厚度的判斷：切片表面的反射光和切片下表面反射光 產(chǎn)生的干涉顏色為依據(jù)，不同厚度切片呈現(xiàn)不同的顏色。干涉顏色 暗灰色 灰色 銀白色 金黃色 紫色切片厚度 40nm以下 4050nm 5070nm 7090nm 90nm以上取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢21六、染色1.染色原理：使用重金屬鹽類與樣品中的某些成分結(jié)合或 被吸附，以增加電子散射量從而達(dá)到提高反差的目的。電子染色2.電子染色劑：具有特異性常用染色劑為鈾和鉛鹽醋酸鈾：能提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的反差， 對膜系統(tǒng)染色較差。配制： 13%的50%或70%的乙醇溶液，避光保存。鉛鹽：對膜系統(tǒng)、糖元、核蛋白、脂類有較好的

14、染色作用。常用 硝酸鉛和檸檬酸鈉水溶液配成檸檬酸鉛。易產(chǎn)生沉淀污染樣品。配制： 硝酸鉛 1.33g 檸檬酸鈉 1.76g 雙蒸餾水 30mlpH 1112pH4.2用力振蕩30min，呈乳狀懸液，加入8ml 1N的NaOH，溶液透明后加水至50ml取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢223.染色方法(1)單染色：只用一種染色液（鈾）染色的方法。(2)雙染色：鈾鉛染色法(3)塊染色：鉛鈾鉛染色可提高反差石蠟層鈾染2030分鐘鉛染色1530分鐘水洗303次材料固定后、脫水前，整塊用50%乙醇醋酸鈾飽和溶液，4染色212小時，常規(guī)切片鏡檢。取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢234.示蹤性染

15、色多用于免疫電鏡技術(shù)和(酶)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 鏡檢(1)概念：用各種大小的離子、分子等顆粒作為示蹤物， 顯示細(xì)胞間的連接部位與方式，研究細(xì)胞的通透屏障，測量通透孔道的大小，追蹤組織液的生理通路。（2）常用示蹤劑：硝酸鑭（2nm），遼紅（0.76nm）， 無機(jī)膠體金，草酸鈣以及酶類，鐵蛋白等。(3)染色方法：通常將示蹤劑加入進(jìn)所有的處理液中。1%2%硝酸鑭或0.05%0.8%遼紅與戊二醛固定含相同濃度示蹤劑的1%鋨酸含示蹤劑的緩沖液漂洗常規(guī)脫水包埋聚合超薄切片直接鏡檢24硝酸鑭標(biāo)記的蔥根尖細(xì)胞鑭顆粒沉積在細(xì)胞間隙25免疫電鏡技術(shù)：將免疫學(xué)中抗原-抗體反應(yīng)的特異性與組

16、織化學(xué)形態(tài)的可見性，利用電鏡的高分辨率和放大能力，在超微結(jié)構(gòu)和分子水平上研究細(xì)胞的形態(tài)和功能。可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)抗體-抗原的定性、定位研究。如：免疫鐵蛋白、酶（辣根過氧化酶）、膠體金 對鐵蛋白抗體、酶標(biāo)記抗體、膠體金標(biāo)記抗體的定位電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：盡可能保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時，在原位將生物化學(xué)的反應(yīng)在電鏡下顯示出來，從而將結(jié)構(gòu)與功能的研究結(jié)合起來。如：酶在細(xì)胞內(nèi)的定位 核酸（DNA、RNA）脂肪、碳水化合物的定位 各種無機(jī)離子（鈣離子）定位等26膠體金標(biāo)記的葉綠體2728超薄切片制作小結(jié)一、制作環(huán)節(jié)應(yīng)掌握“六要一防”取材要準(zhǔn)確 固定要及時 漂洗要充分 脫水要徹底浸透要完全 切片要均勻 染色防污染二

17、、不同材料制作特點(diǎn)：動物組織：取材迅速，固定及時；植物材料：調(diào)節(jié)處理時間，確保滲透徹底；游離細(xì)胞：注意收集，以防樣品丟失；孢粉、花粉以及藻類：預(yù)包埋收集，完全浸透。29三.處理時間脫水過渡浸透聚合包埋切片染色取材前固定漂洗后固定漂洗 準(zhǔn)確防損傷24h3次/15min12h8 級/ 15min34h2次/15min3級/48h鈾染：1530min鉛染：1015min500700微黃色黑色或深褐色防止污染04室溫30第三節(jié) 負(fù)染色技術(shù)一負(fù)染色及其原理：1.負(fù)染色：即陰性染色利用高電子密度、并且在電鏡下不顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽類在樣品四周的堆積而增強(qiáng)樣品外圍的電子密度，從而襯托出樣品的形態(tài)和大小。載網(wǎng)和

18、膜樣品染色液2.原理：電子束通過原子序數(shù)高的物質(zhì)時，與其電子和原 子核碰撞的幾率較高，容易發(fā)生散射而形成負(fù)反差。 任何物體若被密度比本身大2倍以上的物質(zhì)所包圍或 浸沒時，電鏡下反差得到加強(qiáng)而形成負(fù)反差。 3132二.負(fù)染色樣品的制備具有一定濃度和純度的懸浮液（一）直接取樣法：用于含雜質(zhì)少而具有一定濃度的樣品1.生長在固體培養(yǎng)基上的微生物：用接種環(huán)刮下配成 雙蒸餾水懸浮液即可滴樣或沾樣。2.放線菌孢子：雙蒸餾水從菌體上洗下成懸液即可滴樣。3.皮膚皰疹（水痘等）用毛細(xì)管穿刺取樣，直接滴膜。4.植物染病體：切碎后雙蒸餾水懸浮片刻即可沾樣。 需保持活體的植物，刺破表皮處滴加蒸餾水， 待病毒游離出來即可

19、沾樣。33負(fù)染色樣品的制備（二）樣品提純法：用于雜質(zhì)較大的材料1.離心提純法：用于血清、糞便、尿樣、痰液、活組織、植物研磨破碎懸浮液低速離心：25003000rpm,10min,棄沉淀（細(xì)胞碎片）高速離心：15000rpm,60min,取沉淀適當(dāng)稀釋即可沾樣。2.透析提純法：除去鹽類雜質(zhì)樣品滴在漂浮在水面的膜是甲醛蒸汽固定1520分鐘靜置透析324小時撈網(wǎng)染色3.瓊脂過濾提純法：瓊脂板樣品膜瓊脂過濾20分鐘蒸餾水漂浮剝離撈膜染色34(三)病毒樣品濃縮方法1.紅血球吸附法：用于多數(shù)黏液病毒和副黏液病毒濃縮病毒懸液與等量紅血球混合靜置5分鐘使病毒粒子吸附于紅血球上；低速離心（1000轉(zhuǎn)以下）15分

20、鐘，棄上清；加入少量生理鹽水，低溫（4）靜置34小時使病毒釋放于溶液中；取該懸浮液即可滴膜負(fù)染。吸附離心分離懸浮滴染2.細(xì)胞低滲釋放法將培養(yǎng)細(xì)胞刮下低速離心，棄上清；在沉淀中加入4倍體積蒸餾水，使細(xì)胞因低滲膨脹破 裂而釋放出病毒，再快速凍融數(shù)次；再低速離心，取上清液滴膜負(fù)染。3.抗體病毒凝結(jié)法：形成“病毒抗體”復(fù)合物離心濃縮， 取沉淀制成懸浮液樣品即可負(fù)染色。如：風(fēng)疹病毒、 肝炎病毒。4.植物染病體：低溫保存研磨破碎離心上清液負(fù)染色35四.負(fù)染色劑密度比生物樣品大四倍以上的重金屬鹽類(一)負(fù)染色劑的特征:具有較高的電子密度和散射能力； 較高的熔點(diǎn)；較高的溶解度，不易析出沉淀；分子小易 滲透；化學(xué)穩(wěn)定而不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(二)常用負(fù)染色劑及其特點(diǎn) 1.磷鎢酸(PTA)、磷鎢酸鉀(KPT)、磷鎢酸鈉(NaPT)特點(diǎn)：顆粒細(xì)，反差好，圖象背景干凈;溶液：13%的水溶