樹脂型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒

1、樹脂型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒操作方法將35ml菌液13,000rpm離心30秒收集沉淀（菌體）。如果用1.5ml或2ml離心管則需反復(fù)離心23次。倒掉上清，將沉淀（菌體）完全懸浮于100l懸浮液（溶液I）中。上清要盡可能去除干凈，可用濾紙吸干。沉淀要用混旋器完全懸浮，否則將直接導(dǎo)致下一步的裂解不徹底，進(jìn)而影響質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和純度。加入150l裂解液（溶液II），輕柔地顛倒混勻10次左右，溶液逐漸變得粘稠、清亮。不可用混旋器劇烈振蕩，否則會使質(zhì)粒DNA斷裂；裂解時間不宜超過5分鐘，否則會造成染色體DNA的污染及質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率降低。加入150l中和液（溶液III），輕柔地顛倒混勻10次左右。

2、此時可見到白色絮狀的染色體DNA及細(xì)菌碎片。13,000rpm離心810分鐘，將上清液小心轉(zhuǎn)入一個新的1.5ml離心管中，加入0.4ml純化樹脂（使用前充分混勻），顛倒混勻3分鐘。此步是通過離心去除染色體DNA及細(xì)菌碎片，并使處于高鹽狀態(tài)下的質(zhì)粒DNA與純化樹脂結(jié)合。將純化樹脂及上清液的混和物吸入離心純化柱中，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。將離心純化柱重新套入廢液收集管中，加入600l 80%異丙醇（或80%乙醇），13,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。如果離心純化柱底部殘留有異丙醇（或乙醇），可用濾紙吸干，否則將影響以后的酶促反應(yīng)。此步是洗滌質(zhì)粒DNA中混有的

3、雜質(zhì)及鹽類。重復(fù)第7步12次，盡可能將雜質(zhì)去除。取出離心純化柱，將其套入一個干凈的1.5ml離心管，開蓋放置23分鐘，將殘留的異丙醇或乙醇揮發(fā)干凈。加入50l TE緩沖液（若用于測序，則加50l超純水）于純化樹脂上，不能粘在管壁上。室溫下放置3分鐘后，13,000rpm離心1分鐘。此步是將純化樹脂上的DNA洗脫下來。如果對質(zhì)粒DNA的需求量較大的話，則重復(fù)此步驟12次，這樣可以獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。TE緩沖液或無菌超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。離心柱放入離心管中，若蓋不上蓋子，亦沒有關(guān)系，可開蓋離心。離心管中收集的液體即是洗脫下來的質(zhì)粒DNA，取12l電泳（0.8%瓊脂糖，120V，1

4、520分鐘）檢測其純度并目測定量。若發(fā)現(xiàn)有RNA污染，可加入0.5l RNase A（10mg/ml），37保溫30分鐘。此操作不影響其后續(xù)實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)充說明如果起始菌液體積較大或收集的菌體較多，溶液 = 1 * ROMAN I、 = 2 * ROMAN II、 = 3 * ROMAN III的用量及其它試劑可相應(yīng)放大。但操作略有不同，需要時我們樂于提供幫助。實(shí)驗(yàn)證明，少量的RNA污染對于酶切、轉(zhuǎn)化及測序無明顯的影響。常見問題及參考意見常見問題可能原因參考意見質(zhì)粒產(chǎn)量低細(xì)胞裂解不充分減少培養(yǎng)物體積。對于高拷貝質(zhì)粒，培養(yǎng)物體積不要超過5ml，低拷貝質(zhì)粒培養(yǎng)物體積不要超過10ml按比例增加溶液 = 1

5、 * ROMAN I與溶液 = 2 * ROMAN II的體積，使菌體充分懸浮，然后完全裂解細(xì)胞非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大量生長必須在選擇條件下擴(kuò)增質(zhì)粒DNA定量不準(zhǔn)確通過瓊脂糖凝膠電泳與已知濃度的質(zhì)粒DNA比對不合適的保存條件將質(zhì)粒DNA溶于無菌超純水或TE中，于-20保存菌液的放置時間過長從培養(yǎng)過夜的新鮮菌液中提質(zhì)粒DNA菌液培養(yǎng)的時間過長在新鮮的選擇平板上挑選一個分隔良好的單菌落，于37振蕩培養(yǎng)1216小時質(zhì)粒的拷貝數(shù)太低增加培養(yǎng)物體積，但不要超過10ml溶液 = 2 * ROMAN II及純化樹脂（于結(jié)合液中）有結(jié)晶出現(xiàn)將溶液 = 2 * ROMAN II及純化樹脂（于結(jié)合液中）置于37溫浴30m

6、in以上，使結(jié)晶完全溶解，且在使用前要充分混勻洗脫溫度過低加入無菌超純水或者TE浸透樹脂后，于37溫育2分鐘洗脫液pH7.0的無菌超純水洗脫洗脫液中沒有質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA漂出點(diǎn)樣孔增加甘油或蔗糖助沉質(zhì)粒丟失在新鮮的選擇平板上挑選生長良好的單克隆進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)對質(zhì)粒DNA進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化雜菌污染在選擇平板上挑選生長正常的菌落進(jìn)行搖菌電泳時質(zhì)粒呈現(xiàn)額外條帶開環(huán)質(zhì)粒DNA及線狀質(zhì)粒DNA的存在加入裂解液后，輕輕混勻，時間不要超過5min可能存在缺失突變體有些質(zhì)粒如cosmids長期保存于E.coli中是不穩(wěn)定的，在搖菌時應(yīng)在選擇平板上挑選新鮮的，分隔良好的單克隆存在質(zhì)粒多聚體單酶切后，質(zhì)粒多聚體酶切為線

7、狀質(zhì)粒DNA，可與染色體DNA的污染相區(qū)別存在變性的超螺旋質(zhì)粒DNA加入裂解液后，堿裂解時間不要超過5分鐘RNA污染菌體過量，導(dǎo)致RNase A相對量不足減少培養(yǎng)菌液的體積溶液 = 1 * ROMAN I放置時間超過6個月于100l溶液 = 1 * ROMAN I中加入1l RNase A（10 mg/ml），或于洗脫液中加入0.5l RNase A，37溫育30min以上染色體污染操作過于劇烈加入溶液 = 2 * ROMAN II、溶液 = 3 * ROMAN III之后，輕柔地顛倒混勻，不要劇烈振蕩裂解時間過長裂解時間不要超過5分鐘細(xì)菌培養(yǎng)期間，出現(xiàn)細(xì)胞裂解菌液的培養(yǎng)時間不要超過16小時質(zhì)粒DNA易降解核酸酶的存在更換菌株，有些菌株，例如HB101、TG1、JM100等含有高水平的核酸內(nèi)切酶活性使用滅菌的玻璃及塑料制品DNA在酸性環(huán)境中脫嘌呤用pH7.0的無菌超純水或TE洗脫質(zhì)粒DNA；若非用于測序，最好用TE質(zhì)粒DNA在下游操作過程中出現(xiàn)問題鹽的濃度過