幾種骨組織脫鈣液比較

1、幾種骨組織脫鈣液比較曹 穎 (第三軍醫(yī)大學病理研究所, 重慶, 郵編 400038)摘要: 目的比較幾種骨組織的脫鈣溶液與脫鈣方法, 獲得快捷、簡便、適用于臨床病理檢驗的脫鈣技術。方法考察在常溫、恒溫、攪拌狀態(tài)下，幾種常用的脫鈣液對豬干骨中段脫鈣、染色效果。結果40度恒溫攪拌條件下，脫鈣溶液（鹽酸/氯化鈉、高濃度鹽酸/甲酸/氯化鈉、低濃度鹽酸/甲酸/氯化鈉、EDTA、Plank-Rycho）具有脫鈣時間短、組織損傷小、不影響染色效果。結論恒溫攪拌條件下，脫鈣溶液（鹽酸-氯化鈉、高濃度鹽酸-甲酸-氯化鈉、低濃度鹽酸-甲酸-氯化鈉、EDTA、Plank-Rycho）比較適合于臨床病理檢驗中骨組織的

2、脫鈣。關鍵詞：脫鈣液；骨組織；臨床病理Comparative study on decalcification solutionsAbstract Objective: To get simple, quick, and suitable demineralization for clinic application, A comparative study on the effects of various decaclification solutions was performed. Methods: To investigate the influences of temperatur

3、e, operation mode, and ingredients of decalcification solution on dyeness and demineralization of pig cortical bone. Results: The demineralization with short time as well as no effect on dyeness and tissue results from the solutions of hydrochloric acid/sodium chloride, concentrated hydrochloric aci

4、d/formic acid/sodium chloride, diluted- hydrochloric acid/formic acid/sodium chloride, EDTA, and Plank-Rycho under stirring at 40 degree. Conclusions: Decalcification solutions of hydrochloric acid/sodium chloride, concentrated hydrochloric acid/formic acid/sodium chloride, diluted- hydrochloric aci

5、d/formic acid/sodium chloride, EDTA, and Plank-Rycho under stirring at 40 degree are the better systems for demineralization in clinic pathology.Key words: decalcification solution; bone tissue; clinic pathology 作者簡介：曹穎 女 湖南長沙市人，主管技師，長期從事臨床病理技術工作。電話email: 脫鈣是決定骨骼、牙齒、病理性鈣化或骨化組織切片質量、染色效果

6、的重要技術關鍵之一。簡單、便捷、快速、有效的骨組織脫鈣方法，有利于保持骨組織結構和組織中的抗原物質，對于臨床正確診斷具有重要的意義。目前報道的脫鈣液和脫鈣方法比較多1-3 ，但尚無公認的理想方法2，為此我們擬對幾種倍受推崇的脫鈣液進行實驗比較，期望獲得適合于臨床病理檢驗的骨組織脫鈣液組成與脫鈣方法。1.材料與方法1.1 材料取新鮮的豬干骨，手術刀去除軟組織與骨膜，大量水漂洗，用骨鋸切取干骨中段，獲得組織體積為10mm5mm1.5mm的骨塊，在4 %中性甲醛液內固定 24 h，用于脫鈣實驗。1.2 脫鈣液組成選取文獻報道比較多的幾種脫鈣溶液，用于考察操作條件、脫鈣溶液組成對骨組織的脫鈣效果。各種

7、脫鈣溶液的組成及配制如下：溶液(鹽酸/氯化鈉)：5ml HCl + 15g NaCl + H2O 至100ml。溶液(鹽酸/甲醛/甲酸)：30ml HCl + 30ml 甲醛 + 20ml甲酸 + H2O 至100ml。溶液(鹽酸/醋酸/水楊酸)：8mlHCl + 5ml冰醋酸 + 10g水楊酸+ H2O 至100ml。溶液(高濃度鹽酸/甲酸/氯化鈉)：8mlHCl + 15g NaCl + 20ml甲酸+ H2O 至100ml。溶液(硝酸/尿素/甲酸)：8mlHNO3 + 3g尿素 +20ml甲酸+ H2O 至100ml。溶液(硝酸/尿素)：8mlHNO3 + 3g尿素+ H2O 至100m

8、l。溶液(低濃度鹽酸/甲酸/氯化鈉)：5ml HCl + 15g NaCl + 10ml甲酸+ H2O 至100ml。溶液(EDTA)：10g EDTA二鈉+ H2O 至100ml。溶液(Plank-Rycho)：8.5mlHCl + 7g AlCl3 + 5ml甲酸+ 10m甲醛+ H2O 至100ml。1.3 脫鈣方法將5塊體積為10mm5mm1.5mm的骨塊置于100ml脫鈣液中，在攪拌與靜置實驗條件下，分別考察室溫和恒溫40的脫鈣效果。整個脫鈣進程中不更換脫鈣液。脫鈣終點判斷：隨時觀察脫鈣情況，用大頭針試探能穿入骨密質即可。病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織的結構。2.實驗結果表1是

9、在靜置與攪拌操作方式下，不同溫度與脫鈣溶液組成對豬干骨的脫鈣結果。實驗結果表明，對于同一種脫鈣溶液，攪拌狀態(tài)下的脫鈣時間小于靜置狀態(tài)；40恒溫條件下的脫鈣時間比常溫條件下短。在所有的脫鈣液中，溶液(鹽酸/甲醛/甲酸)脫鈣需要的時間最短，EDTA絡合劑( 溶液)脫鈣時間最長，其余的各種脫鈣液的脫鈣時間相差不大。在脫鈣骨基質的外觀完整性方面，利用溶液(鹽酸/甲醛/甲酸)和 溶液(鹽酸/醋酸/水楊酸)脫鈣后，骨基質外部明顯破損，而其他脫鈣溶液基本不損傷骨基質，表明對組織損害非常小。在切片染色效果方面（圖1A、B），除了溶液(鹽酸/甲醛/甲酸)和 溶液(鹽酸/醋酸/水楊酸)外，用其他脫鈣液制備的脫鈣骨

10、基質，染色效果差異不顯著，表明脫鈣過程對組織結構顯影不明顯。同時，脫鈣后抗原保持完整（圖1C）。表1不同脫鈣液與脫鈣條件對脫鈣時間及基質的狀態(tài)影響脫鈣實驗條件靜態(tài)脫鈣(小時)攪拌脫鈣(小時)室溫40室溫40 溶液7278667064685862 溶液4375 b3943 b3943 b3842 b 溶液7074 b6670 b6468 b6165 b 溶液7175636764685761 溶液7074636764685761 溶液7074667065695658 溶液6973636763675963 溶液368392228252252268172188 溶液7377656961655862注：

11、b表示脫鈣后，骨基質外觀結構不完整。 A 20 B20 C40 圖1脫鈣骨基質的HE染色及免疫組化染色 脫鈣：溶液(鹽酸/氯化鈉) 脫鈣液，40度，攪拌；A）豬密質骨HE染色；B)人肌纖維腫瘤HE染色；C) 人肌纖維腫瘤免疫組化Ki67 3.討論簡便、快捷、有效的脫鈣方法是骨組織病理學研究的重要步驟之一。脫鈣技術和溶液多種多樣，在眾多的脫鈣液中，螯合劑脫鈣溶液因對骨的有機質損害最小、抗原保持最完整，是倍受推崇的一種脫鈣方法。但是，脫鈣時間特別長，尤其是對于大塊的骨組織樣品更是如此。為了提高脫鈣處理效率，許多學者研究了微波脫鈣技術6，但微波處理需要多次間歇操作，需要專門人員守護，這在一定程度上限

12、制了微波絡合劑脫鈣方法在臨床上的應用。酸類脫鈣溶液是傳統(tǒng)的脫鈣方法，脫鈣技術成熟、操作簡便，也可以通過微波、升溫、攪拌等等方式加速脫鈣進程 1,3,6，如李玲等1研究了新西蘭兔雙側橈骨，在恒溫、室溫、微波條件下脫鈣，結果表明，對于選定的三種脫鈣溶液，恒溫和微波脫鈣速度顯著高于常溫，而恒溫與微波脫鈣時間無統(tǒng)計學差異，組織切片、染色的效果也相當。本實驗結果顯示，除了溶液和 溶液外，其他脫鈣液均具有脫鈣完全，對組織損害小，不影響染色效果的特點。其中，脫鈣溶液（、）含有HCl，雖然各溶液的含酸濃度各不相同，但脫鈣的時間和效果相差不大。這可能是由于脫鈣的速度取決于溶解的鈣離子、磷酸根離子在組織中的擴散（

13、攪拌狀態(tài)下，脫鈣時間縮短是擴散過程決定脫鈣速度的佐證之一）。由于增大酸度并不能顯著改變擴散速度，所以這四種脫鈣溶液脫鈣時間與效果相當。脫鈣溶液（、）含有大量的NaCl強電解質，氯化鈉具有降低溶液中離子的活度，導致骨組織中無機鹽（羥基磷灰石）的溶解度增加、膠原的酸解程度降低，保證了脫鈣骨組織的結構完整性5；脫鈣溶液 則是利用溶液中的鋁離子在基質上的吸附、溶液中離子活度的降低，達到保護組織不受破壞的目的。脫鈣溶液（、）中的硝酸氧化性比較強，對于抗原具有一定的破壞作用，不利于抗原的檢測。杜德利等人提出HAS（即溶液）是一種較快速的脫鈣溶液。但是，對本實驗的密質骨脫鈣效果不理想，組織破壞也嚴重。究其原

14、因，可能是水楊酸對膠原松弛作用，使得骨組織表面有機質很快被酸解，并形成保護膜，阻礙了脫鈣溶劑進入骨組織內部，而降低脫鈣速率，并嚴重破壞脫鈣骨基質表層的有機質結構。綜上所述，筆者認為，恒溫攪拌條件下，應用溶液（、）脫鈣具有：脫鈣完全、快速，對組織影響小，不需要專人守護，操作簡便等特點，是一種比較適合于臨床病理檢測的脫鈣方法。參考文獻：李玲,趙燚,曹湘梅,等. 室溫、恒溫與微波骨組織脫鈣實驗方法的比較. 寧夏醫(yī)學院學報. 2008,30(3):395-397劉大維,初同偉,張良,等. EDTA 微波脫鈣骨的免疫組化染色. 第三軍醫(yī)大學學報. 2003,25(1):77-78薛世泉,李紅兵,王渝,等. 骨和牙切