發(fā)酵過程控制（ControlofFermentationProcess)第四章生物傳感器簡介

1、發(fā)酵過程控制（Control of Fermentation Process)第四章生物傳感器簡介第四章 生物傳感器4.1 概述4.2 生物傳感器基本原理4.3 酶傳感器4.4 微生物傳感器4.5 其他生物傳感器什么是傳感器？某工藝參數(shù) 傳感器 電、熱、光 變換器 電信號轉換器數(shù)字量傳感器三要素：（1）直接觸被測物；（2）可傳遞性；（3）輸出信號與被測參數(shù)有明確的關系，最好是線性關系。4.1 概述4.1.1 什么是生物傳感器功能：被測物質濃度生物傳感器可傳遞信號數(shù)字量組成：生物傳感器 固定化生物材料具有專一性功能（感受器）轉換器具有傳遞性功能生物傳感器的發(fā)展歷程：酶法分析具有高度專一性，但操作

2、復雜、時間長。固定化酶使酶法分析自動化，但不具備傳遞性，只能取樣檢測。電極具傳遞性，但不具備專一性。氧電極pH電極生物傳感器的發(fā)展歷程：4.1.2 生物傳感器的特點（1）特異性好：能從復雜的系統(tǒng)中準確測出某一物質的濃度。（2）靈敏度高：可檢測濃度的物質，最小極限為10-10g/mL。（3）穩(wěn)定性相對較差：檢測結果易受物理和化學環(huán)境因素的影響。（4）不能加熱殺菌處理：其中的生物物質有失活的可能，因此一般不能加熱殺菌處理。（5）制作工藝精細，廢品率高，成本昂貴。4.1.3 生物傳感器的分類 （1）根據(jù)生物物質分類（感受器）酶傳感器各種酶微生物傳感器微生物細胞細胞器傳感器細胞膜、線粒體、電子傳遞體、

3、微粒體等細胞器組織傳感器細胞組織免疫傳感器抗原、抗體基因（DNA）傳感器核酸（DNA、RNA）生物傳感器 感受器轉換器（2）根據(jù)轉換器分類 生物物質發(fā)出的信號 轉換器 可傳遞信號信號轉換器生物反應產生的信號電極式各種電極活性物質，如O2、CO2、H+、NH4+等熱敏電阻式熱光電纖維式光半導體式電場壓電晶體式氣體等離子體共振式磁場4.1.4 應用領域與前景生物傳感器的應用領域（1）在酵工業(yè)方面：主要是各種酶傳感器和微生物傳感器 如：糖、甲醇、乙醇、醋酸、甲酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、抗生物質、氨、甲烷、BOD及菌體數(shù)等生物傳感器 。（2）環(huán)境檢測方面：應用較多的是各種微生物傳感器 如：

4、BOD、NH3、NOX、SOX、甲烷及各種重金屬離子等BOD、NH3、NOX、SOX、甲烷及各種重金屬離子等。 （3）醫(yī)療方面：主要是酶傳感器、免疫傳感器、基因傳感器 如：血清檢查和尿樣檢查等。 （4）食品分析：主要是各種酶傳感器、免疫傳感器4.2 生物傳感器的原理電極式生物傳感器原理電極式生物傳感器 電極式生物傳感的組成：電極活性物質 電 極被測物質膜生物催化劑酶 、微生物抗體、抗原細胞器、細胞組織輸出電信號電化學反應電極式生物傳感器原理示意圖 電極式生物傳感器原理模式：被測物質 固定化生物催化劑膜 電極活性物質 電 極 電信號 生物化學反應電化學反應電極活性物質電極活性物質指易于在電極上反

5、應的物質，如：O2、CO2、H2O2、H+、NH3等 。例如：被測物質生物催化劑膜電極活性物質(反應生成或消耗物質) 電極乳酸乳酸氧化酶膜消耗O2氧電極(電流)L-賴氨酸L-賴氨酸脫羧酶膜生成CO2CO2 電極(電壓)電極的轉換方式電流法電極活性物質在電極上反應產生電流。 常用電極有：氧電極、H2O2電極、燃料電池型電極等。電壓法電極活性物質有選擇地感應產生膜電壓。 常用電極有：離子選擇電極、氨電極、CO2電極等。其它生物傳感器原理 被測物質固定化生物催化劑膜 熱 熱敏電阻 電信號 生物化學反應被測物質固定化生物催化劑膜 光 光計數(shù)器 電信號 生物化學反應其他信號： 電場電場磁場4.3 酶傳感

6、器酶傳感器是應用固定酶膜作為識別被測物質敏感元件（感受器）的生物傳感器。酶傳感器包括酶電極傳感器、酶光纖傳感器和酶熱敏電阻傳感器等。 Clack最初提出了使用酶進行電化學測定的原理。希克斯（Hicks）和厄迪克（Updick） 首先研制成了測定葡萄糖的酶傳感器。 4.3.1 酶反應與轉換器的耦聯(lián)耦聯(lián)關系是指酶反應所生成（如：H2O2、CO2等）或消耗（如O2等）的某種物質，能被轉換器轉換成電信號。 酶傳感器中轉換器與酶反應的耦聯(lián)關系酶 例耦聯(lián)物質轉換器轉換器輸出信號氧化酶、過氧化氫酶等O2氧電極電流H2O2H2O2電極電流脫氫酶NADH燃料電極電流尿酶、酰氨酶NH4+ （酸性）銨電極電壓尿酶、

7、脫氨酶NH3（堿性）氨電極電壓脫羧酶CO2CO2電極電壓脂肪酶、青霉素酶H+玻璃電極電壓4.3.2 固定化酶膜（EBM）的制備（1）固定化方法包埋法：活性損失最小，但不適于測量大分子底物；共價法、交聯(lián)法：活性損失較大，適應性較廣。（2）酶膜制備酶膜制備實例:將乙醇氧化酶和聚乙烯亞胺及牛血清蛋白溶液混合起來，加入5%（V）戊二醛溶液，在5下，存放4小時。這種酶的混合物包在聚碳酸脂膜（孔徑）和醋酸纖維素膜之間，并在5使其風干24h。用0.02%（V）戊二醛溶液處理，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，即制得乙醇氧化酶膜(厚度約20m)。（3）酶膜的性質 使用壽命：與使用環(huán)境條件（溫度、pH等）有關，一般為一個月

8、左右。響應特性:4.3.3 酶傳感器實例 例1：葡萄糖傳感器：傳感器組成： 葡萄糖氧化酶聚丙烯酰胺凝膠 包埋法葡萄糖氧化酶膜 氧電極葡萄糖傳感器葡萄糖傳感器示意圖 PbPt記錄儀空氣被測溶液電解質溶液聚四氟乙稀膜固定化葡萄糖氧化酶膜 例1：葡萄糖傳感器： 電極反應： C6H12O6 + O2 葡萄糖氧化酶 C6H10O6 + H2 O2 葡萄糖 葡萄糖酸 在酶膜上： 在氧電極上：在Pb陽極：PbPb2+2e在Pt陰極：1/2O2+H2O+2e2OH PbPt記錄儀空氣被測溶液電解質溶液聚四氟乙稀膜固定化葡萄糖氧化酶膜測定原理： 主要性能 測量范圍：1500 mg/L 響應時間：1030 s 使

9、用壽命：60100 day葡萄糖 酶催化反應 電極旁O2濃度電化學反應 電流值葡萄糖濃度 酶膜上 氧電極上 氧化酶膜與過氧化氫電極組成葡萄糖傳感器： 例2：乙醇傳感器： 傳感器組成：將固定化乙醇氧化酶膜用圓形橡膠環(huán)裝在過氧化氫電極的表面，即組成乙醇傳感器。 電極反應： 酶膜上的反應：乙醇 乙醛電極上的反應：在Pt陽極上：H2O22H+O2+2e在Ag陰極上：1/2O2+2H+2eH2O測定原理 電極主要性能乙醇 酶催化反應 生成H2O2 電化學反應 電流值推算乙醇濃度 乙醇氧化酶膜 H2O2電極A測量范圍：030%（V）；B相對誤差：2%；C響應時間：20S；D使用壽命：半衰期30天左右。某些

10、酶傳感器一覽表待測物質固定化酶轉換器測量范圍(mg/L)響應時間（min）穩(wěn)定性(day)葡萄糖葡萄氧化酶鉑電(H2O2)氧電極(O2)151031510215(S)10(S)60100100各種糖蔗糖酶、變旋酶葡萄糖氧化酶氧電極(O2)1005000514乳酸乳酸脫氫酶燃料電極(NADH)100030 (S)14乙醇乙醇脫氫酶乙醇氧化酶原電池鉑電極(H2O2)1430尿素尿酶銨電極(NH4+)氨電極(NH3)1010001010000.51242130青霉素青霉素酶玻璃電極(H+)1010000.52714L-酪氨酸酪氨酸脫羧酶CO2電極(CO2)1010412204.4 微生物傳感器在酶傳

11、感器制造中，首先遇到的困難就是酶的提取與精制。 微生物膜作為分子識別元件利用：利用微生物細胞內單一或多個酶的機能類似于酶傳感器；利用微生物的生理機能。4.4.1 微生物傳感器的原理與分類酶活性測定型以微生物酶催化反應的活性為指標；（類似于酶傳感器）呼吸活性測定型以微生物呼吸活性為指標；電極活性物質測定型以微生物代謝產物為指標。（1）呼吸活性測定型必須是好氣性微生物氧濃度 氧電極 電流值 CO2生成 CO2電極 電位值 氧 微生物利用的被測物質好氣微生物膜（2）電極活性物質測定型包括厭氧和好氧微生物待測物質固定化微生物膜 CO2 CO2電極 電位式 H2 鉑陽極，Ag2O2陰極 電流式 NH3

12、氨電極 電位式 H+ 玻璃電極 電位式 還原型輔酶 燃料電極 電流式 4.4.2 微生物傳感器特點（1）微生物較酶易獲得，價格相對較低；（2）穩(wěn)定性好，連續(xù)使用時間可達一個月左右；（3）響應時間比酶傳感器長，多數(shù)在10分鐘左右；（4）特異性較酶傳感器差。 4.4.3 微生物傳感器實例例1：谷氨酸傳感器谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸的反應為： HOOC-(CH2)2-CHNH2-COOH 谷氨酸脫羧酶 HOOC-(CH2)2-CH2NH2 + CO2（1）傳感器制備大腸桿菌細胞冷凍干燥用水調勻涂布于尼龍網（60目，7mm）兩面置于CO2電極上外用賽璐酚膜蓋住谷氨酸傳感器電極膜（硅橡膠膜）細胞尼龍網(大腸

13、桿菌)賽璐酚膜 CO2 電 極（2）測定原理（3）主要性能 A響應時間：5min左右； B測量范圍：10800mg/L； C使用壽命：20day。 在無氧條件下 （4）專一性： A對谷氨酰胺有響應，對其它氨基酸的作用可忽略。 B葡萄糖、醋酸時，無影響。 C無機離子影響可忽略。 例2：氨傳感器（1）測定原理硝化菌氧化銨的反應要消耗氧：NH4+ + O2 硝酸菌 NO2NO2 + O2 硝化細菌 NO3 NH4+ 微生物反應 電極旁O2濃度電化學反應 電流值推算NH4+濃度 硝化菌膜上 氧電極上（2）傳感器制備活性污泥 分離 硝化菌固定于乙酸纖維素膜安裝于氧電極上測定銨（氨）微生物傳感器 氧電極

14、Pt乙酸纖維素膜(硝化菌)透氣膜聚四氟乙烯膜（3）主要特性響應時間：2min(pH=10的緩沖溶液中)測量范圍：142 mg/L相對誤差：14乙醇T. brassicae氧電極5301030醋酸T. Brassicae氧電極101001020甲酸C. butyricum鉑陽極、Ag2O2陰極13003030谷氨酸E. ColiSarcina flaveCO2電極NH3電極10800201000552014賴氨酸E. coliCO2電極10200514天冬氨酸B. CacaverisNH3電極0.590510頭孢菌素Citrobacter fenundipH電極100500107其他生物傳感器免

15、疫電極傳感器免疫電極(immuno bioelectrode)是以免疫物質（抗原或抗體）作為敏感元件的電化學生物傳感器。免疫物質的高特異性識別使免疫電極具有很高的特異性。 根據(jù)測定過程是否需要標記物可分為直接免疫電極（direct immuno electrode）和間接免疫電極（indirect immuno electrode）。 （1）直接免疫電極不用任何標記物 例如（設抗體為被測物）：抗體電信號（電壓）電化學或電學變化膜電壓變化特點：不需額外試劑，儀器要求簡單，操作容易，響應快；缺點：靈敏度低，因而難以作為標準檢測方法 （2）間接免疫電極需要制備酶標抗體或酶標抗原結合物 利用標記物將免

16、疫反應的信號放大后間接測定抗原或抗體，這類電極稱為間接免疫電極，亦稱酶聯(lián)免疫測定法或ELISA法（enzyme linked immunoassay）。例如（設抗體為被測物）：推測試樣中抗體濃度 抗體 固定化酶標抗原膜抗體與酶標抗原結合 改變酶標抗原存在狀態(tài)固定化酶標抗原膜底物狀態(tài)改變的酶標抗原催化底物反應 反應速度與試樣中抗體濃度有關 4.5.2 DNA傳感器DNA測定主要指靶DNA的檢測、DNA序列測定和DNA雜交測定。DNA測定在分子生物學及其基因操作研究、臨床診斷、反恐偵檢、食品安全、檢疫等方面應用廣泛。傳統(tǒng)的DNA檢測主要依靠膜上分子雜交和電泳，其特點是技術要求高，時間長、成本高、效

17、率低。近年來DNA傳感器和DNA列陣的出現(xiàn)，使DNA的檢測大大減化。（1）DNA傳感器的特點特異性好。穩(wěn)定性好離體DNA比蛋白質（酶）分子穩(wěn)定。制備簡單，DNA可用儀器批量合成。DNA的操作方法具有通用性，容易標準化。結合芯片技術，可制備DNA列陣，實現(xiàn)高通量測定。靈敏度高，可以達到10-11mol/L以上。用途極其廣泛。（2）DNA傳感器的分類按轉換器的不同可分為電極型（電化學型）、光學型和質量型等。其中應用最廣泛的電極型DNA傳感器，根據(jù)其作用原理的不同可分為五大類：A. 直接DNA電化學型（direct DNA electrochemistry）B. 間接DNA電化學型（indirect DNA electrochemistry）C. 特異性氧化還原指示劑型（specific redox indicator）D. DNA介導的帶電輸出型（DNA-mediated charge transport）E. 納