01.蛋白質化學-PPT課件

1、什么是生物化學？ 生物化學是研究生命化學的科學，它在分子水平探討生命的本質，即研究生物體的分子結構與功能、物質代謝與調節(jié)、及其在生命活動中的作用。 緒 論學習內容生物大分子的結構與功能： 蛋白質化學、核酸化學、酶物質代謝及其調節(jié) 糖、脂、氨基酸、核苷酸代謝， 生物氧化、代謝聯系與調節(jié)遺傳信息的傳遞 DNA復制、RNA轉錄、蛋白質生物合成、 基因表達調控、基因重組與基因工程專題篇 細胞信息傳遞、癌基因、抑癌基因與生長因子、血液生化、肝膽生化學習生化基本方法與要求基本概念要清楚重點內容要掌握章節(jié)之間會聯系課后復習很重要第一章蛋白質化學楊笑菡北京大學醫(yī)學部生化與分子生物學系第一節(jié) 蛋白質（prote

2、in）在生命活動中的重要性 核蛋白是最簡單的生命形式 煙草花葉病毒阮病毒分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80。1. 蛋白質是生命的物質基礎2、蛋白質的重要生物學功能3、氧化供能1）生物催化劑：酶2）代謝調節(jié)作用：激素 ，受體，G蛋白，等3）防御作用：免疫球蛋白 ，等4）物質轉運：血紅蛋白 ，等5）運動與支持：肌動蛋白，等6）營養(yǎng)和存儲：酪蛋白，卵清蛋白，等7）結構蛋白 ：膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白 ，等8）其他：毒蛋白，甜味劑，等第二節(jié) 蛋白質的分子組成一、元素組

3、成：碳 50-55氫 6-8氧 20-23氮 15-17硫 0-3其他 微 量 其中 N含量16蛋白質含量氮含量/16氮含量6.25蛋白質含量？凱氏定氮法測定蛋白質含量的理論依據1、主要元素：碳、氫、氧、氮和硫，有些蛋白質還含有少量磷和金屬元素。2、特點：各種蛋白質的含氮量很接近，平均含氮量為16%。3、定氮法測定蛋白質含量： 蛋白質含量6.25樣品含氮量 1/16%小結二、結構單位氨基酸（amino acid）（一）氨基酸的一般結構式存在自然界中的氨基酸有300多種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20余種，絕大多數蛋白質只由20種氨基酸組成，且屬 L-氨基酸（甘氨酸，脯氨酸除外）。 蛋白質 肽

4、 氨基酸水解水解酸/堿/酶氫原子氨基羧基側鏈基團-碳原子氨基酸的基本結構H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R 脯氨酸（亞氨基酸） 按其側鏈的結構和理化性質分類非極性、疏水氨基酸(非極性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支鏈）；Met（含硫）；Phe , Trp （芳香族）；Pro（亞氨基）；Ala（脂肪烴 ）極性、中性氨基酸(不帶電荷的極性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羥基）；Tyr（芳香族）；Cys（含硫）；Gln, Asn（含酰氨） ；Gly（無旋光異構）（二）氨基酸的分類 酸性氨基酸（含有兩個羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 堿性氨基酸（含有兩個以上氨基）

5、： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）含硫氨基酸：Met、Cys芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp非極性疏水性氨基酸2. 極性中性氨基酸3. 酸性氨基酸4. 堿性氨基酸蛋白質基本結構單位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亞氨基酸）除外 L氨基酸：甘氨酸（無不對稱C）除外 氨基酸結構通式：RCH(NH2)COOH 常見氨基酸種類：20種。小結(zwitterion)pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子 陽離子陰離子三、氨基酸的理化性質1、兩性解離氨基酸的等電點pH pI正電荷 兩性離子 負電荷負極移動（電場中） 不移動 正極移動等電點（isoelectr

6、ic point, pI）：在某一pH環(huán)境中，氨基酸解離成陽性離子及陰性離子的趨勢相等，所帶凈電荷為零，在電場中不泳動。此時，氨基酸所處環(huán)境的pH值稱為該氨基酸的等電點。2、紫外吸收：Trp、Tyr和Phe在280nm波長附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm3、顯色反應：（1）茚三酮反應氨基酸與茚三酮水合物共熱，生成藍紫色化合物，其最大吸收峰為570nm，可用于氨基酸定量分析。例外：Pro黃色；Asn棕色等電點（isoelectric point, pI）：在某一pH環(huán)境中，氨基酸解離成陽性離子及陰性離子的趨勢相等，所帶凈電荷為零，在電場中不泳動。此時，氨基酸所處環(huán)境的pH

7、值稱為該種氨基酸的等電點(pI)。等電點計算：兩性離子兩邊的pK值的算術平均值。帶電狀態(tài)判定： pI-pH （正數帶正電，負數帶負電）紫外吸收：Trp、Tyr和Phe在280nm波長附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm小結 （一）氨基酸的成肽反應-羧基和-氨基之間脫去一分子水形成的酰胺鍵，是蛋白質中氨基酸間最基本的連接方式。三、肽鍵和多肽鏈 肽分類、命名* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。* 由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(

8、oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。甘氨酰甘氨酸 多肽鏈蛋白質的基本結構形式多肽鏈 (NHCHCONHCHCO)多肽鏈的方向性：從N末端指向C末端。（二）生物活性肽：谷胱甘肽神經肽：腦啡肽、內啡肽、強啡肽、P物質、Y肽肽類激素：催產素、加壓素等其他：生長因子；短桿菌S；甜味肽等谷胱甘肽(glutathione, GSH) 體內許多激素屬寡肽或多肽1、連接方式：肽鍵肽鍵(peptide bond)：一個氨基酸的羧基與另一氨基酸的氨基縮水而成的酰胺鍵稱為肽鍵。（CONH）肽平面(peptide unit)：由肽鍵中的四個原子（-CO-NH-）和與

9、之相鄰的兩個碳原子共同構成的剛性平面（CCONHC）。2、生物活性肽：谷胱甘肽：Glu-Cys-Gly，Glu以羧基形成肽鍵 3、蛋白質的基本結構形式：多肽鏈多肽鏈 (NHCHCONHCHCO)多肽鏈的方向性：從N末端指向C末端。小結四、蛋白質的分類1、按照組成分類：單純蛋白、結合蛋白單純蛋白：只有氨基酸組分結合蛋白：氨基酸組分其他組分（輔基）2、按照結構分類：單體蛋白、寡聚蛋白單體蛋白：只有一條多肽鏈寡聚蛋白：數條多肽鏈非共價相互作用超家族（super-）、家族（family）、亞家族（sub-） 3、按照生物功能分類：酶、調節(jié)蛋白、轉運蛋白、運動蛋白、防御蛋白、營養(yǎng)蛋白、儲存蛋白、結構蛋白

10、、毒蛋白4、根據形狀分類：纖維蛋白、球狀蛋白第三節(jié)蛋白質的分子結構一級結構(primary structure)二級結構(secondary structure)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structure)纖維狀蛋白質球狀蛋白質一、蛋白質的一級結構(primary structure) 多肽鏈中氨基酸的排列順序。 半胱氨酸 +胱氨酸二硫鍵-HHN末端C末端牛核糖核酸酶二硫鍵一級結構是指蛋白質的多肽鏈中氨基酸的排列順序一級結構體現生物信息：20n .多樣一級結構是空間結構及生物活性的基礎.特異一級結構的連接鍵：肽鍵（主要）、二硫鍵小結-螺旋

11、 (- helix) -折疊 (- pleated sheet)-轉角(- turn)無規(guī)則卷曲（random coil）二、二級結構肽鍵具部分雙鍵性，不能自由旋轉肽鍵中的四個原子（-CO-NH-）和與之相鄰的兩個碳原子（C1、 C2）位于同一剛性平面內，稱為肽單元 。肽鍵上H與O的方向幾乎總是相反，稱反式肽單元（trans-peptide unit），該構型更穩(wěn)定。CNHHHORRCNHHHORR1.肽單元2.-螺旋存在于纖維狀蛋白質（角蛋白：皮膚、毛發(fā)、指甲、和角）和球狀蛋白質中。3.-折疊(-pleated sheet)存在于纖維狀蛋白質（ -角蛋白：蠶絲、蜘蛛絲中絲心蛋白）和球蛋白中。

12、-轉角一般由四個氨基酸組成，常見氨基酸：Pro,Gly以主鏈間氫鍵維持穩(wěn)定。多肽鏈中180度回折處形成的特定構象。沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構，存在于球狀蛋白質中。（常常是酶的功能部位） 4.無規(guī)卷曲1、-螺旋(-helix)右手螺旋：3.6個AA/圈，螺距0.54nm；氫鍵維系：鏈內氫鍵（AA1AA4），平行長軸；側鏈伸出螺旋蛋白質的二級結構是指多肽鏈骨架中原子的局部空間排列，不涉及側鏈的構象，也就是該肽段主鏈骨架原子的相對空間位置，主要有-螺旋、-折疊、-轉角和無規(guī)則卷曲。維持二級結構的力量為氫鍵。小結2、-折疊(-pleated sheet)多肽鏈充分伸展，肽平面折疊成鋸齒狀；側鏈交錯位于鋸

13、齒狀結構的上下方；氫鍵維系：氫鍵的方向垂直長軸；可有順平行片層和反平行片層結構。3、其它（1）肽鏈主鏈出現的180回折部分稱-轉角。（2）蛋白質分子中那些沒有確定規(guī)律性的部分肽鏈構象稱為無規(guī)卷曲。（三）蛋白質的三級結構次級鍵介導蛋白質高級結構形成1、疏水鍵2、離子鍵3、范德華力疏水作用蛋白質的三級結構是指在一條多肽鏈中所有原子的整體空間排布，包括主鏈和側鏈。三級結構的形成使得在序列中相隔較遠的氨基酸側鏈相互靠近。 長度縮短：球形、橢球形、桿狀，等多數同時含有-螺旋和-折疊氨基酸位置由側鏈極性決定：非極性（內）、極性（表面，少數內部）、帶電（表面）次級鍵維系：疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力、二硫鍵

14、功能區(qū)：表面或特定部位小結（四）、蛋白質的四級結構血紅蛋白四聚體亞基(subunit)：寡聚蛋白中的單條獨立的多肽鏈，具有獨立的一、二、三級結構，單獨存在時一般無生物學活性。亞基之間以非共價鍵聯系，亞基可以相同或不同。亞基之間以非共價鍵聯系，包括疏水鍵（主要）、鹽鍵、氫鍵、范德華力亞基可以相同或不同第四節(jié)蛋白質結構與功能的關系蛋白質一級結構是空間結構和生物功能的基礎，一級結構決定空間結構；但一級結構并非決定空間結構的唯一因素。空間結構是生物活性的直接體現。一、一級結構與功能的關系（一）一級結構是空間結構的基礎 例如：核糖核酸酶的變性與復性 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇 去除尿素、-

15、巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性一級結構適當的溶液環(huán)境分子伴侶（chaperone）酶：蛋白質二硫鍵異構酶，肽基脯氨酸順-反異構酶影響多肽鏈折疊的因素圖解：助人為樂的分子伴侶太太很快出現在需要她盡力而為的場所（新生肽鏈的折疊，越膜，應激反應等情況），她主動去發(fā)現她應該幫助的正在成長的新生肽姑娘（識別折疊中間物），熱情地伸出友誼之手（相互作用和結合），并發(fā)出警戒之言不！不！別往哪兒走！，防止她們誤入歧途掉進不可自拔的死亡深淵（防止錯誤的相互作用導致的無效折疊和不可逆聚集），從而幫助她們沿著朝向正確目標的光明大道前進（有利于有效折疊成功能蛋白的正確折疊途徑）。新生肽姑娘健康地成長（正確折疊）。折疊好的蛋

16、白質小姐愉快地，昂首闊步地準備去做自己的貢獻（折疊成特定的空間構并獲得生物活性的功能蛋白 )分子伴侶幫助新生肽鏈正確折疊 生物名稱 不同氨基酸數 生物名稱 不同氨基酸數黑猩猩 0 恒河猴 1豬、牛、羊 10 馬 12雞 13 海龜 15金槍魚 21 小蠅 25小麥 35 酵母 44不同生物和人的細胞色素c 中氨基酸組成的差異（二）蛋白質一級結構的種屬差異與分子進化 狗人猴 馬騾 鯨 兔豬袋鼠企鵝雞 鴨響尾蛇龜蒼蠅 蛾脈孢菌屬念珠菌屬面包酵母菌小麥牛 蛙金槍魚動 物爬行動物兩棲動物魚哺乳動物鳥昆 蟲植 物脊椎動物從細胞色素C的一級結構看生物進化N-val his leu thr pro glu

17、glu C(146) HbSHbAN-val his leu thr pro val glu C(146) 分子病（molecular disease） ：由于蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病。鐮刀形紅細胞貧血?。ㄈ┑鞍踪|的一級結構與分子?。?結構改變，功能改變正常紅細胞鐮形紅細胞1、一級結構中的保守序列決定空間結構（1）不同蛋白質之間的比較：相似結構相似功能、不同結構不同功能（2）同一蛋白質不同狀態(tài)的比較：一級結構決定空間結構【經典舉例】蛋白變性與復性（3）保守序列、保守氨基酸改變，功能改變；保守氨基酸不變，功能不變【經典舉例】分子病小結2、一級結構并非影響空間結構的唯一因素分子伴娘(mol

18、ecular chaperons，分子伴侶)：在蛋白質加工、折疊形成特定空間構象及穿膜進入細胞器的轉位過程中起關鍵作用的一類蛋白質。與未折疊的肽段（疏水部分）進行可逆的結合，輔助二硫鍵的正確形成；引導肽鏈的正確折疊并集合多條肽鏈成為較大的結構；可以解聚錯誤聚合的肽段，防止錯誤發(fā)生。肌紅蛋白與血紅蛋白的結構 二、空間結構與功能的關系空間結構體現生物活性：結構相似，功能相似肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。空間結構體現生物活性：結構改變，功能改變一個寡聚體蛋白

19、質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協(xié)同效應(cooperativity) 。 正協(xié)同效應(positive cooperativity)：促進作用負協(xié)同效應(negative cooperativity)：抑制作用別構效應（變位效應，allosteric effect）：蛋白質分子的特定部位與小分子化合物結合后，引起空間構象改變，從而促使生物學活性變化的現象。瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉

20、變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。PrPc-螺旋PrPsc-折疊正常瘋牛病朊病毒致病過程中的構象變化示意圖1、空間結構體現生物特異性2、空間結構體現生物活性3、空間結構的靈活性，體現了生物活性的可調節(jié)特性空間結構中的特定區(qū)域體現生物活性小結別構效應（別位效應、變位效應，allosteric effect）：蛋白質分子的特定部位（調節(jié)部位）與小分子化合物（效應物）結合后，引起空間構象發(fā)生改變，從而促使生物學活性變化的現象稱為變構效應。包括正協(xié)同、負協(xié)同效應【經典舉例】血紅蛋白（Hb）：由22四聚體組成，每個亞基含有1個血紅素輔基；Hb的氧解離曲線呈“S”型。多種空間構象，多種活性狀態(tài)4、空間

21、構象并非生物活性的唯一影響因素【舉例】低溫下酶活性低，但并不影響構象；鹽析時沉淀的酶無活性，但構象不變。 5、蛋白構象疾?。哄e誤構象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病。老年癡呆瘋牛病亨汀頓舞蹈病第五節(jié)蛋白質的理化性質及分離純化 1、蛋白質的兩性電離 一、理化性質 蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 * 蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點

22、。2、蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。3、蛋白質的膠體性質 蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內。 * 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜+帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜酸堿酸堿溶液中的蛋白質+帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉+帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜酸堿酸堿4、蛋白質的沉淀（Pre

23、cipitation）5、變性（Denaturation）、結絮和凝固概念：在某些理化因素作用下，蛋白質的空間構象破壞，導致若干理化性質和生物學性質的改變。變性因素：1）物理因素：高溫、高壓、射線等2）化學因素：強酸、強堿、重金屬鹽等 變性后的表現：1）生物學活性消失2）理化性質改變變性的意義：高溫、高壓、紫外線殺菌；防止酶制劑失活，等5、蛋白質的呈色反應（1）茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質水解后產生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應。（2）雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲

24、反應可用來檢測蛋白質水解程度。1、兩性解離與等電點：同“氨基酸兩性解離”2、紫外吸收：最大吸收波長280nm 3、膠體性質：不能透過半透膜4、沉淀、凝固蛋白質在溶液中維持穩(wěn)定的因素： 表面電荷、水化層（溶劑化層）變性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定變性（1）沉淀：不穩(wěn)定蛋白質從溶液中析出（2）結絮：變性蛋白質的絮狀沉淀，沉淀可溶于強酸、強堿（3）凝固：沉淀結塊，凝塊不溶于強酸、強堿小結沉淀/變性沉淀變性（1）變性：在某些理化因素作用下，蛋白質的空間結構被破壞，從而導致其理化性質改變、生物活性喪失的現象稱為變性。變性不涉及一級結構的變化。理化性質的變化：紫外吸收、化學活性及粘度上升，易被蛋白酶水

25、解；溶解度下降、結晶能力喪失。5、變性(denaturation)、復性(renaturation)（2）復性（3）應用利用變性：酒精消毒，高壓滅菌防止變性：低溫保存生物制品取代變性：乳品解毒(用于急救重金屬中毒)6、呈色反應：雙縮脲反應，等雙縮脲反應可檢測蛋白質的水解程度二、蛋白質的分離純化1、透析及超濾法* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。* 超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。2、鹽析、有機溶劑沉淀及免疫沉淀 *丙酮、乙醇等有機溶劑，可破壞蛋白質的水化層，在04低溫下，使蛋白質沉淀。環(huán)境溫度

26、高等不良因素影響下，有機溶劑可促使蛋白質變性。*鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。 * 免疫沉淀法：利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 3、電泳蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據支撐物不同，分為薄膜電泳、凝膠電泳等幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。4、層析(chromatography)或色譜法待分離蛋白質溶液（流動