實驗四酵母RNA提取

1、酵母RNA的提取11、實驗?zāi)康?、掌握稀堿法提取RNA的原理和方法2、學(xué)習(xí)和了解其它提取RNA的方法和原理22、實驗重點和難點離心機(jī)的使用提取RNA的實驗原理33、實驗原理一般的生物細(xì)胞中同時含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多， RNA（2.6710.0%），DNA則少于2(O.03O.516)，在實驗室常用酵母作為RNA提取的材料。若要制備具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若對生物活性沒有要求，則可使用濃鹽法，稀堿法等。工業(yè)中用稀堿法或濃鹽法，主要用于制備核苷酸的原料.4苯酚法：組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上

2、層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。濃鹽法：在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細(xì)胞膜的透性，使RNA 釋放出來，再利用等電點（pH為2.02.5）沉淀。此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。鹽濃度需要控制，太低，RNA不易從細(xì)胞中釋放出來，太高，細(xì)胞急劇收縮不利于抽提。一般80120g/L為宜。5稀堿法：利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；本實驗采用的稀堿，既可加速細(xì)胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。當(dāng)堿被中和后，可用乙醇(或者異丙醇）將RN

3、A沉淀，或用等電點沉淀RNA(應(yīng)嚴(yán)格控制pH,緩慢調(diào)),此為 RNA的粗品。6核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。7核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解8（1）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。（2）磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀(NH4)3PO412MoO3,有還原劑存在時，形成藍(lán)色鉬藍(lán)。9(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2OH3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3（鉬藍(lán)）還原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長660nm測定

4、吸光值，當(dāng)無機(jī)磷含量在125g 范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量為9.5%，即1g RNA磷相當(dāng)于10.5 g RNA。DNA的含磷量平均為9.9%。Vit C10（3）地衣酚(苔黑酚）顯色法：RNA與酸共熱時降解，形成戊糖，繼而形成糠醛（-呋喃甲醛），糠醛與地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應(yīng)，形成鮮綠色復(fù)合物，可用比色法測定。當(dāng) 核糖核酸濃度在 10100g/ml 范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線性關(guān)系需要FeCl3或Cu2+作催化劑。114、實驗操作(一)RNA的提取（1）稱5g干酵母粉于150 ml三角燒瓶中，加25ml O.2的 NaOH，沸水浴中攪拌提取20 min。冷卻后滴加

5、乙酸使其略偏酸性，pH約5-6，目的是去除蛋白質(zhì)。（2）離心(4000 rmin，13 min)，去除沉淀。上清液冰浴。（3）向上清液中加入20 ml（約上清液的兩倍體積）95乙醇，稍攪拌后靜置（冰浴約10min）。待完全沉淀后離心(4000 rmin，15 min) ，去上清液。（4）沉淀用95乙醇洗兩次（如沉淀浮起需再次離心），每次約10mL;用乙醚洗兩次，每次10mL。目的是去除脂溶性物質(zhì)和水，乙醚的沸點比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。12(二)RNA的鑒定 取沉淀約1g，加10 ml 10H2SO4沸水浴中加熱30 min。（5）嘌呤堿 取水解液2mL加入2mL濃氨水，然后

6、加入約1mL 5%硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤堿時，沉淀上浮，搖勻，沉淀下沉）（6）核糖 取1支試管加入水解液0.5mL、1mL苔黑酚三氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中2分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。時間久了會有黑色沉淀，是濃度高，產(chǎn)物結(jié)晶出來了。135、注意事項避開磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍2070，防止RNA 降解。在90100條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。在調(diào)pH 值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)行。在洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導(dǎo)致RNA 部分溶解而造成損失，降低RNA 提取率。 14提取 RNA 時必須用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，NaOH 必須實現(xiàn)預(yù)熱。 用乙酸調(diào) pH56 必須有，目的可以除去一些雜質(zhì)。 最后過濾前必須將乙醇瀝干，不能帶水，否則 RNA 會粘在濾紙上，