實(shí)驗(yàn)五 人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)(1)jsp

1、實(shí)驗(yàn)五 人類淋巴細(xì)胞株培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）二、培養(yǎng)基的配制三、細(xì)胞傳代培養(yǎng)四、死活細(xì)胞的鑒別五、細(xì)胞生長曲線的測定1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪塥?dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的個(gè)中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。2二、實(shí)驗(yàn)原理清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無菌操作的要求程度很高。細(xì)胞培養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。滅菌手段的選擇也十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特

2、性或其他使用價(jià)值也不行。3四、儀器、材料和試劑（一）儀器超凈工作臺(tái)、干燥箱、高壓鍋、過濾器（二）材料微孔濾膜（直徑25mm）：孔徑為0.22um(三）試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、 HCl等4五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗 先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和有害物質(zhì)。2.使用過的玻璃器皿的清洗（1）立即進(jìn)入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過夜；（4）從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙）；（6）高壓（15磅20min)或干

3、熱（160度2h)滅菌；（7）備用。5（二）膠塞處理（1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。（2）自來水清洗10次（3）用1%稀鹽酸浸泡30min。（4）自來水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干（5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。6（三）塑料制品的清洗（1）用洗滌劑清洗，自來水沖洗數(shù)遍（2）強(qiáng)（次強(qiáng)）酸洗液浸泡26h.（3）自來水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次（4）浸泡在70%乙醇0.51h,備用。（5）用前從乙醇中取出，在超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外線照射1h。7（四）Tip和Tube的清洗（1）新的國產(chǎn)Tip和Tu

4、be如用于非RNA提取時(shí)可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。（2）用于RNA提取時(shí)，用蒸餾水刷洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡過夜晾干，高壓滅菌后使用。（3）使用過的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗過，自來水清洗10次晾干，進(jìn)洗液224h。晾干，放入飯盒高壓滅菌，備用。8（五）洗液的配制常用的洗液是硫酸-重鉻酸鉀溶液。洗液可根據(jù)需要配制不同的濃度成分強(qiáng)酸洗液次強(qiáng)酸洗液重鉻酸鉀63g3150g120g6000g濃硫酸1 000ml50 000ml200ml10 000ml蒸餾水200ml10 000ml1 000ml50 000

5、ml9配制方法：（1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。（2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸并用一長玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意：操作時(shí)注意安全，穿戴好耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應(yīng)立即用大量清水沖洗。10（六）消毒和滅菌（1）射線消毒滅菌主要使用X、60Co進(jìn)行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。（2）紫外線消毒一般用無臭氧型紫外燈。一般20min，71%細(xì)菌消滅；40min后79%細(xì)菌消滅，60min后86%細(xì)菌消滅。紫外線照射時(shí)間照射再長也不能100%滅菌，最多只能達(dá)到90%。11（3）干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放入干燥箱內(nèi)，加熱至160度，保溫90120min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需要180度，保溫58h.（4）濕熱滅菌也稱高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用布類、橡膠、金屬器械、玻璃器皿、塑料以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液。（5）濾過滅菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液。12（七）化學(xué)消毒法（1）70%（75%）酒精消毒（2）0.1%新潔爾