實(shí)驗(yàn)八凱氏定氮法

1、實(shí)驗(yàn)八 凱氏定氮法測(cè)定樣品中粗蛋白的含量1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2.學(xué)會(huì)使用凱氏定氮儀。 2二、實(shí) 驗(yàn) 原 理1.消化：有機(jī)物中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO4/K2SO4，濃H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4； 2NH3+H2S04+2H+ (NH4)2S042.蒸餾：在凱氏定氮器中與堿作用，通過(guò)蒸餾釋放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中； (NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O33.滴定:用已知濃度的HCI標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的

2、換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3 二、實(shí) 驗(yàn) 原 理41、豆?jié){粉2、濃硫酸3、混合催化劑：CuSO4/K2SO4=0.4/64、混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液200ml與0.1%甲 烯藍(lán)乙醇溶液50ml混合5、 NaOH:40%6、 2%硼酸溶液7、0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液三、實(shí)驗(yàn)器材5四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）消化 精密稱(chēng)取豆?jié){粉1.0 g，移入干燥消化管中，加入混合催化劑6.4g，搖勻后再加入15ml濃硫酸和兩顆玻璃珠，放入消化爐中消化。起始電壓150V，消化1h后，觀察消化管內(nèi)泡沫變化，泡沫消失后，加強(qiáng)火力到220V，繼續(xù)消化，至

3、液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。 取下消化管放冷，小心加蒸餾水至50ml ，混勻備用。取與處理樣品相同量的混合催化劑按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。6（二）蒸餾（1）裝好蒸餾裝置，如圖：四、實(shí)驗(yàn)步驟7（2）洗滌蒸餾裝置在蒸氣發(fā)生燒瓶中加約70顆玻璃珠，2/3體積的蒸餾水，加入45滴濃硫酸及45滴混合指示劑。沿小漏斗加入蒸餾水約20mL到反應(yīng)室，留半漏斗水，保持水封，防止漏氣。加熱產(chǎn)生蒸氣后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開(kāi)關(guān)，蒸氣進(jìn)入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過(guò)定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個(gè)錐形瓶接收冷凝水。四、實(shí)驗(yàn)步驟8從定氮球發(fā)燙開(kāi)始計(jì)時(shí)，連續(xù)蒸煮

4、5min，停止加熱。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接硅膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動(dòng)抽到蒸汽收集器中，打開(kāi)廢液排出口夾子放出廢液。四、實(shí)驗(yàn)步驟9（3）蒸餾樣品向接收瓶?jī)?nèi)加入20ml2%硼酸溶液及混合指示液2滴，并使冷凝管的下端插入液面下吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小漏斗流入反應(yīng)室，并以5ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)。將10ml40%氫氧化鈉溶液經(jīng)小漏斗緩緩流入反應(yīng)室，立即加半漏斗水水封以防漏氣，開(kāi)始蒸餾。蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過(guò)冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi)，從指示劑開(kāi)始變色時(shí)計(jì)時(shí)，蒸餾5min。移動(dòng)接受瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾1min。四、實(shí)驗(yàn)步驟10（三）滴定 用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡紫紅色為滴定終點(diǎn)。(四)洗滌凱氏定氮儀（按照上述方法）四、實(shí)驗(yàn)步驟11五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品的總氮含量(%)=(AB)0.1145/1000C若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)(如血清)，則：樣品中的蛋白質(zhì)含量(%)=(AB)0.1146.255/1000CA滴定樣品用去