診斷和治療的意義ppt課件

1、JAK2基因突變對于骨髓增殖性腫瘤的分類、診斷和治療的意義中山大學附屬第三醫(yī)院血液科徐妍 碩士研討生 1、MPD：是一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞不斷的克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。 2、MPD包含慢性粒細胞白血病CML，真性紅細胞增多癥PV，原發(fā)性血小板增多癥ET，和原發(fā)性骨髓纖維化PMF,慢性中性粒細胞白血病CNL，慢性嗜酸細胞白血病/高嗜酸細胞綜合癥CEL/HES等多種疾病。 一、骨髓增殖性疾病MPD MPD的病因和發(fā)病機制尚未完全明確。2005年發(fā)表在Nature上的一篇文章初次報道了JAK2突變發(fā)生于多種MPD，在他們的研討中，約80的PV患者存在JAK2基因突變，導致基因

2、編碼產物第617位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸奖彼帷６?、MPD發(fā)病機制 這一變化導致JAK激酶相關的特異性的受體酪氨酸磷酸化活性繼續(xù)加強，使紅細胞對細胞因子如EPO的反響加強，繼續(xù)激活JAK-STAT信號途徑，從而發(fā)生PV，這一機制在小鼠模型中得到證明。 同樣地，JAK2 V617F也存在于其他MPD中1 。 這個基因突變的發(fā)現(xiàn)無疑對MPD的分類、診斷和治療產生了深遠的影響。1 James C, Ugo V, Le Coudic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes po

3、lycythaemia vera. Nature, 2005,434:1144-1148. 三、JAK-STAT信號途徑細胞因子與其相應受體結合后，引起細胞質受體構象的改動，進而激活與受體相關聯(lián)的JAK激酶，JAK激酶可以使特異性受體的酪氨酸殘基磷酸化，進而促使相應的STAT因子磷酸化，從而激活STAT因子。最后，激活的STAT蛋白從受體上游離構成二聚體，進入細胞核內與GASgamma activated site加強子家族成員相結合，誘導靶基因表達。JAKJAKStatStatStatStatStatStat胞漿胞核胞漿表示圖：JAK-STAT信號途徑可以激活JAK2激酶的受體包括：EPO-

4、R,TPO-R,GM-CSF-R,IL-3R,gp130受體家族等。研究組 PVET骨纖其他對照組Jones AV 2 58 /72 (81%) 24 /59 (41%) 15 /35 (43%) 30/ 152(20%) 0/160（0）Vainchenker W 3 80% 3025-750%Nelson ME 4 74% (n = 506) 36% (n = 339) 7% (n = 556) Fei HR 5 42 / 57(73.7%) 40/ 68 (58.8%)8/12(66.7%) Lucia E 6 90.2% 72.1 %63.2 %50%_2 Jones AV, Krei

5、l S, Zoi K, et al.Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders Blood. 2005;106(6):2162-8. 3 Vainchenker W, Constantinescu SN.A Unique Activating Mutation in JAK2 (V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of Myeloprolifer

6、ative Diseases.Hematology. 2005:195-200. 4 Nelson ME, Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders: what do we know now, and where are we headed? Leuk Lymphoma. 2006 Feb;47(2):177-94. 5 Fei HR, Zhang R, Chen SN, et al.The clinical implication of JAK2 mutation expression in patients with myeloprolife

7、rative disorders. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2007 Apr;46(4):271-3. 6 Lucia E, Martino B, Mammi C, et al.The incidence of JAK2 V617F mutation in bcr/abl-negative chronic myeloproliferative disorders: assessment by two different detection methods. Leuk Lymphoma. 2021 Oct;49(10):1907-15. 參考文獻： 在修訂的2021 WH

8、O分類系統(tǒng)中，有無JAK2突變成為MPD主要的診斷目的7 。1假設JAK2突變陽性，血紅蛋白添加，骨髓紅系細胞明顯增生可以診斷PV，即使血紅蛋白低于以往WHO規(guī)定的目的值，但卻繼續(xù)超越正常值 20g/L的PV也可以確診。2假設JAK2突變陽性，血小板僅僅繼續(xù)大于450X109/L,骨髓巨核細胞增生，可以診斷ET。 四、 2021 WHO分類系統(tǒng)7 Tefferi A and Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2021 World Health Organization cr

9、iteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2021, 22, 1422 原WHO關于PV診斷規(guī)范如下：A1：紅細胞比積增高比正常平均值25或血紅蛋白男性185g/L、女性165g/L；A2：無引起繼發(fā)性紅細胞增多緣由如無家庭性紅細胞增多癥，無低氧血癥動脈P0292、無高氧親和力血紅蛋白，無截短的促紅素Epo受體和無腫瘤分泌EPO所致EPO升高；A3：脾大；A4：骨髓細胞無Phbcrabl，但可有其他克隆性遺傳學異常；A5：體外培育有內源性紅系集落構成； B1：血小板增多40010g/L；B2：白細胞1210g/L；B3：骨

10、髓活檢示全髓系增生以紅系和巨核系增生明顯；B4：血清EPO減低；具有A1+A2+任何A項或Al+A2+B項中任何2項均可診為PV.(3)不僅MPD的診斷發(fā)生革命性進展，連稱號都改動了。MPD改稱為骨髓增殖性腫瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN)，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)稱為MDS/MPN。新分類的MPN 中還包含了肥大細胞病MCD。(4)以前的慢性嗜酸細胞白血病/高嗜酸細胞綜合癥CEL/HES分別重新劃分為CEL，HES和有PDGFRA, PDGFRB或者FGFR1基因異常的嗜

11、酸細胞增高癥3種MPN，并強調這類疾病的本質是腫瘤. 現(xiàn)已明確，MPN具有共同的干細胞來源的克隆型遺傳特征，臨床出現(xiàn)不同表型是突變影響的蛋白、酪氨酸激酶及相關分子的不同構型和異常的信號轉導所呵斥的。 1、MPN診斷規(guī)范的根據(jù):多數(shù)患者都具有JAK2突變，主要是JAK2 V617F, 還有JAK2外顯子12突變。由于JAK2 V617F是髓系細胞特異性的，在PV以外其他緣由呵斥的紅細胞增多癥并不出現(xiàn)，因此是PV的一個敏感的診斷標志。 五、JAK2突變對于MPN的診斷意義2、但是，髓系腫瘤中JAK2 V617F并非PV獨有， 還可見于50%的ET或PMF。但其他髓系腫瘤JAK2 V617F發(fā)生頻率

12、很低，淋巴系腫瘤不出現(xiàn)。僅檢測JAK2 V617F 突變雖然不能單獨用來區(qū)分不同類別的MPN，但是結合骨髓活檢的組織學根據(jù)，可以診斷ET和PMF，排除反響性的血小板增多和骨髓纖維化。 3、JAK2 突變在PV診斷中意義最大，而診斷ET或PMF時那么能夠未發(fā)現(xiàn)JAK2 V617F，緣由除了大約一半患者確實無突變外，還由于目前的檢測方法并沒有規(guī)范化。4、運用直接測序、位點特異性PCR和熒光定量PCR檢測JAK17F基因突變的方法會出現(xiàn)一些差別。不同方法的檢測靈敏度不同，突變檢出率能夠不同。通常直接測序檢測的靈敏度約20-25%，位點特異性PCR方法約1-3%，熒光定量PCR方法約0.5-5% 79

13、 。 參考文獻：7 Murugesan G, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probes and melting curve analysis. Am J Clin Pathol, 2006, 125:625-633.8 Vannucchi AM, Pancrazzi A, Bogani C, et al. A quantitative assay for JAK2(V617F)

14、mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis. Leukemia, 2006, 20:1055-1060.9 McClure R, Mai M, Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Leukemia, 2006,20:168-171. 5、突變類型：攜帶

15、純合型還是雜合型等位基因以及突變細胞的比例都與臨床病癥有關，對MPD并發(fā)癥的發(fā)生率及預后都有重要意義； PV患者較ET或IMF患者更多攜帶純合型突變細胞10、11 。10 Ross L. Levine, Claude Belisle, et al. X-inactivationbased clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a

16、 subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis. Blood, 2006,107:4-4141.11 Linda M. Scott, Mike A. Scott,et al. Progenitors homozygous for the V617F mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential thrombocythemia. Blood, 2006, 108:2435-2437. 6、突變

17、量：臨床任務對患者雜合型/純合型突變克隆的攜帶情況，突變比例的定量檢測也越來越注重。轉染JAK2 V617F突變基因的小鼠模型可出現(xiàn)類似PV的表型，突變基因表達量進一步增高時可以進展為骨髓纖維化，而在突變基因低表達的小鼠模型中可以察看到一過性的血小板增多12 。 MPD疾病過程中臨床病癥和JAK2 V617F突變攜帶比例的變化很能夠與雜合型突變向純合型突變的基因轉變有關13 。12 Lacout C, Pisani DF, Tulliez M,et al. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimic

18、king human PV with secondary myelofibrosis. Blood, 2006, 108:1652-1660.13 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet, 2005, 366:1945-1953.7、JAK2基因突變的發(fā)現(xiàn)也

19、導致其他臨床診斷目的的變化。PV患者血紅蛋白添加或者血細胞容積添加是診斷重要的目的，但并非總是和體內紅細胞總量真正添加紅細胞增多癥相一致。PV有時候可以表現(xiàn)為紅細胞壓積正常，是由于血漿也相應添加了。 既然如此，那么在經(jīng)典MPN(PV, ET 和PMF)血紅蛋白和血細胞容積也不一定有明顯區(qū)別。過去PV專業(yè)協(xié)作組PVSG建議在診斷PV時運用紅細胞總量 (RCM) 來抑制上述缺陷，2001年的WHO規(guī)范開場強調要做骨髓活檢來協(xié)助診斷。 1PV：既然幾乎一切PV患者有JAK2突變，外周血JAK2V617F檢測是當前PV患者首選的檢查。與此同時，該當檢測血清Epo程度，真正的PV同時出現(xiàn)JAK2 V61

20、7F陰性和Epo程度正常或添加的能夠性非常小，血清Epo程度減低檢測可以發(fā)現(xiàn)極少見的JAK2 V617F陰性的PV。 另一方面，也應該思索檢測JAK2 V617F陰性，血清EPO程度正?；蛘叩拖禄颊叩腏AK2外顯子12突變和骨髓活檢。骨髓細胞學變化也是ET，PMF和JAK2突變陰性的PV必需的診斷規(guī)范之一。2 ET、PMF：由于JAK2 V617F見于50% 的ET或PMF，診斷血小板增多和骨髓纖維化患者時應思索JAK2突變。突變出現(xiàn)可以排除反響性骨髓增殖，然而沒有檢出突變并不能排除MPN的能夠性。診斷ET和PMF時通常也需求骨髓檢查。 同樣，ET或PMF類似CML時，尤其是在未發(fā)現(xiàn)JAK2

21、V617F時，在骨髓檢查之初就要思索細胞遺傳學檢查。假設沒有發(fā)現(xiàn)Ph染色體，但是骨髓有小巨核細胞時，應思索做FISH檢測BCR-ABL基因。 WHO診斷規(guī)范(見下頁)陽性目的 1.繼續(xù)性BPC600109L 2.骨髓活檢以巨核細胞系增多為特征，巨核細胞體積較大，多為成熟型陰性目的 1.無PV證據(jù)：骨髓鐵染色正常，紅細胞數(shù)正?；騂b185 g/L(男)或165 g/L(女)2.無CML證據(jù)：無Ph染色體，無bcr-abl交融基因 3.無慢性IMF證據(jù)：無膠原纖維，無或極少網(wǎng)狀纖維 4.無MDS證據(jù)：無del(5q)，t(3；3)(q21；q26)或inv(3)(q21q26)等染色體異常，無明顯

22、的粒細胞增生異常，無或極少有小巨核細胞 5.無以下緣由引起的反響性血小板增多：炎癥、免疫、腫瘤或先前已切脾3ET的治療3不典型MPN：診斷不典型MPN (CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分類的MPN)時，通常要求BCR-ABL陰性, 有紅系造血異常，粒細胞發(fā)育異常，或者單核細胞發(fā)育異常1x109/L。 4 CNL：假設外周血白細胞25x109/L 伴隨80%分葉核中性粒細胞或帶狀中性粒細胞，不成熟粒細胞10%和原始粒細胞1%骨髓中5%原始細胞時，思索CNL。 5不能分類的MPN：假設發(fā)現(xiàn)骨髓形狀學異常的肥大細胞聚集，疑心MCD的時候，該當思索類胰蛋白酶染色檢查骨髓，做流式細胞

23、儀分析尋覓形狀異常的肥大細胞 (CD25陽性), 假設有能夠最好進展KIT D816V突變檢測。當臨床表型和經(jīng)典的或者其他非經(jīng)典的MPN的診斷規(guī)范不符時候，可思索不能分類的MPN。 6CEL-NOC、HES：CEL-NOC包含伴有嗜酸細胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和FGFR1重排的髓系腫瘤。診斷兩者都需求外周血嗜酸細胞計數(shù)1.5x109/L，排除繼發(fā)性嗜酸細胞增多，排除其他急慢性髓系腫瘤，并且沒有表型異常和/或克隆性T淋巴細胞。診斷HES需求沒有細胞遺傳學異常，外周血原始細胞2%或骨髓原始細胞5%兩個條件。 基因檢測在疾病診斷中愈來愈重要，從1960年在CML中發(fā)現(xiàn)了Ph染色體時開場，

24、 除Ph染色體的特征性BCR-ABL基因，陸續(xù)在PV, ET和PMF中發(fā)現(xiàn)JAK2 V617F，PV中JAK2外顯子12突變；在ET或PMF中發(fā)現(xiàn)的PLW515L/K，在伴有嗜酸細胞增多癥的髓系惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1基因重排，在MCD中發(fā)現(xiàn)的KITD816V和其他KIT突變，在幼年型粒單細胞白血病JMML中的發(fā)現(xiàn)RAS通路突變包括 RAS, PTPN11 或者NF1。 這些與髓系惡性腫瘤發(fā)病相關的基因的發(fā)現(xiàn)，最終將導致一些新分類和診斷方式。例如，檢測 FIP1L1- PDGFRA突變(用FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排(用染色體核型或 F

25、ISH)，或者FGFR1易位 (用染色體核型)都是目前原發(fā)性嗜酸細胞增多癥分類及選擇治療方案的必要檢查。 既然JAK2突變廣泛存在于MPN，那么，抑制JAK2基因來治療MPN的藥物也就具有相當?shù)倪\用前景，如抑制JAK2基因表達的藥物TG101209, Go6976, erlotinib都有運用于臨床治療的能夠。 六、JAK2突變對于MPN的治療意義1、TG101209 2007年Pardanani A 等人研制出一種口服的生物小分子TG101209，能抑制JAK2 激酶(IC(50)=6 nM), 而對于其他的激酶如JAK3 抑制造用較弱(IC(50)=169 nM)。它可以抑制表達JAK2V617F 突變的Ba/F3細胞小鼠原B細胞株的生長。在人類表達JAK2V617F 突變的急性髓系白血病細胞株中， TG101209可以促進細胞凋亡，抑制JAK2V617F、STAT5 和 STAT3的磷酸化。這就預示著它能夠治療MPN，且其治療作用在裸鼠模型中得到證明。 2、Go6976 2006年Grandage VL 等人證明G6976在體外實驗中能直接抑制 JAK2. G6976還能抑制表達MPN相關的JAK2 V61