生物：12《基因工程基本操作程序》新人教版選修3副本

1、基因工程的基本操作程序1原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子2真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子 外顯子 啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子3基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體

2、的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定4 目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。一、目的基因的獲取目的基因供體生物細(xì)胞取出DNA限制酶剪去多余部分限制酶1.目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因52、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫(kù)中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成61.概念：基因文庫(kù) （gene library）基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(gene l

3、ibrary)7基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).8基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系9提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)2基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)10某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶11123.如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染

4、色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。134.為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？ 構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，

5、往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。142.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。15PCR技術(shù)原理：前提：原料方式PCR擴(kuò)增儀DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子16 過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560引物與部分模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸17

6、2、具體過程183. 人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成19二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。20目的：組成：1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代，2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn)21啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，

7、有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來22三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)231、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)

8、移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。24過程：25（2）基因槍法（3）花粉管通道法262、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法程序：目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物273、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法： 用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子28四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功29（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關(guān)鍵步驟)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針使探針和轉(zhuǎn)基因

9、生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:30知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。31歸納步驟32（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:分 子 雜 交方法:抗原抗體雜交過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA33歸納步驟34(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢測(cè)鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方