《生物制藥工藝學(xué)》課件第三章 基因工程制藥-1

1、第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝基因工程菌：微生物為操作對(duì)象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因或過量或抑制表達(dá)自身基因的工程生物體。種類：細(xì)菌和酵母是重要的表達(dá)重組藥物的制藥生物。3.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)3.1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)3.1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特征細(xì)胞：G-，單細(xì)胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2-3mm。2、生化與遺傳特性能在僅有碳水化合

2、物和氮、磷及微量元素的無機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕-12株的衍生菌株?；蚪M：4.6 Mb，3000多種蛋白質(zhì)。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。3 、質(zhì)粒載體自主復(fù)制不相容性轉(zhuǎn)移性選擇性標(biāo)記多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒類型嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在每個(gè)宿主細(xì)胞只能復(fù)制少數(shù)幾個(gè)拷貝的質(zhì)粒，pSC101；松弛型質(zhì)粒：在每個(gè)細(xì)胞中能復(fù)制幾十至幾百個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，pMB1和colE1。克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴(kuò)增外源基因。測(cè)序質(zhì)粒：用于基因測(cè)序。整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合。穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細(xì)胞存在。表達(dá)質(zhì)粒：能表達(dá)基因產(chǎn)物4、產(chǎn)物表達(dá)形式不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成

3、包涵體包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別?？扇苄缘鞍踪|(zhì)：存在于細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)表達(dá)：外源蛋白被運(yùn)輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表達(dá)：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。5、優(yōu)點(diǎn)和不足發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高（高達(dá)70），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)。不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達(dá)。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容

4、易引起免疫反應(yīng)。6、應(yīng)用大量外源基因能超量的表達(dá)，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長(zhǎng)素(1種PEG化)細(xì)胞因子類：5種干擾素（1種PEG化）、干擾素和，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。3.1.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)1、形態(tài)特征細(xì)胞：?jiǎn)渭?xì)胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。2、生長(zhǎng)與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細(xì)胞，兩個(gè)性別不同的單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體接合

5、子或營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長(zhǎng)繁殖迅速，倍增期約2小時(shí)。釀酒酵母有17條染色體，1996年完成其全基因組測(cè)序，遺傳背景已相當(dāng)清楚?；蚪M：12.068Mb，5887個(gè)ORF，編碼約6000個(gè)基因。3、優(yōu)點(diǎn)與不足五種類型的載體，安全、無毒。營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點(diǎn)：釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長(zhǎng)，會(huì)引起副作用。酵母表達(dá)載體Yip（Yeast intergration plasmid)酵母整合載 含有選擇性標(biāo)記和多克

6、隆位點(diǎn)，有整合序列，通過同源重組整合到酵母染色體中，隨同源染色體一起復(fù)制和遺傳。YEp（Yeast episomal plasmid)酵母附加載體 能自主復(fù)制，高拷貝數(shù)，無需選擇壓力，用于基因表達(dá)YCp（Yeast centomere plasmid)酵母著絲粒載體 能自主復(fù)制，拷貝數(shù)低，用于文庫(kù)構(gòu)建和基因克隆YRp（Yeast replicating plasmid)酵母復(fù)制載體 能自主復(fù)制，高拷貝數(shù)，無需選擇壓力時(shí)容易丟失，用于實(shí)驗(yàn)研究 4、應(yīng)用1981年Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素，細(xì)胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長(zhǎng)因子多肽類

7、：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產(chǎn)品小結(jié)表達(dá)系統(tǒng)：宿主菌+表達(dá)質(zhì)粒生物學(xué)，生產(chǎn)特征大腸桿菌系統(tǒng)酵母系統(tǒng)思考題（1）分析比較基因工程大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)制藥的優(yōu) 缺點(diǎn)，如何選擇應(yīng)用？（2）這兩個(gè)系統(tǒng)生產(chǎn)了哪些重組蛋白質(zhì)藥物？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.2.1 構(gòu)建流程3.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建3.2.3 工程菌構(gòu)建3.2.1 工程菌構(gòu)建流程PCR，文庫(kù)篩選、化學(xué)合成通用載體（1）目標(biāo)基因（2）表達(dá)載體特定載體候選宿主軍工程菌獲得與保存、新

8、性狀、新功能3.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)目標(biāo)基因的定位克隆酶切反應(yīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化篩選與鑒定1、表達(dá)載體的設(shè)計(jì)表達(dá)載體概念：expression vector在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點(diǎn)處插入外源基因表達(dá)盒所構(gòu)成。外源基因表達(dá)盒(操縱子模型)：2、目標(biāo)基因PCR定位克隆PCR技術(shù) (Polymerase chain reaction, PCR)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：由DNA聚合酶催化下，對(duì)特定的DNA 序列進(jìn)行的復(fù)制反應(yīng)。本質(zhì)：生物體的DNA復(fù)制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，生物技術(shù)革命性象征。（2）PCR單反應(yīng)原理與過程（3）PCR循環(huán)（4）PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成模板DNA

9、：目標(biāo)序列,100-10 000bp,pg引物：兩條寡核苷酸，21-27 bp。脫氧核苷酸：4種dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高溫緩沖溶液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl,1.5 mM MgCl2（5）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物程序：溫度，時(shí)間，循環(huán)數(shù)電泳：目標(biāo)基因片段大小，特異性。2、酶切反應(yīng)概念：在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。酶切體系組成：DNA，緩沖液，限制性內(nèi)切酶。反應(yīng)條件：適宜溫度(37)，1小時(shí)以上。終止反應(yīng)：加熱；加入EDTA，螯合鎂離子。電泳檢查：酶切完全性。3、連接反應(yīng)概念：DNA 雙鏈上

10、相鄰的3羥基和5磷酸基因共價(jià)結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶。連接反應(yīng)：16-26，數(shù)小時(shí),或過夜。終止反應(yīng)：在70加熱10分鐘。4、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：某一基因型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細(xì)胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象轉(zhuǎn)染：除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細(xì)胞或原生質(zhì)體的過程.大腸桿菌轉(zhuǎn)化CaCl2法感受態(tài)細(xì)胞融化：置冰上，緩慢。加入連接反應(yīng)產(chǎn)物：混勻，置冰上30分鐘。熱擊：42，90秒。置冰上，1-2分鐘。擴(kuò)增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37，45分鐘。涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)：倒置平板，37

11、，出現(xiàn)菌落。5、篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞類型非轉(zhuǎn)化子：沒有導(dǎo)入外源DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子目標(biāo)重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標(biāo)重組子：不含目的基因重組子（1）篩選方法抗生素篩選法：抗生素的抗性基因，氨芐青霉素?；@白斑篩選法：lacZ基因，重組子白色，非重組子藍(lán)色。噬菌斑篩選法：轉(zhuǎn)化子被裂解形成噬菌斑，非轉(zhuǎn)化子正常生長(zhǎng)。（2）鑒定方法菌落PCR：含有目標(biāo)基因載體大?。弘娪緳z測(cè)酶切鑒定：目標(biāo)基因插入及插入方向測(cè)序確證：目標(biāo)基因的序列準(zhǔn)確無誤，閱讀框架通讀3.2.3 基因工程菌的建立過程：適宜

12、宿主菌的轉(zhuǎn)化篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等。目標(biāo)：獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達(dá)的載體，確保藥物的生物活性。表達(dá)篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達(dá)篩選誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)強(qiáng)度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場(chǎng)所的鑒定表達(dá)部位胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可溶性蛋白表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性鑒定電泳，SDSPAGE，等電點(diǎn)電泳免疫雜交，末端測(cè)序，質(zhì)譜分析分析與目標(biāo)產(chǎn)物的同一性小結(jié)表達(dá)載體構(gòu)建：基因克隆，酶切，連接轉(zhuǎn)化工程菌構(gòu)建：表達(dá)篩選，功能確認(rèn)思考題（1）工程菌構(gòu)建的基本過程是什么，所涉及生物技術(shù)的原理是什么？（2）在大腸桿菌中高效表達(dá)蛋白藥物要著重設(shè)計(jì)哪幾個(gè)方面？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系

13、統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.3 基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.3.1 培養(yǎng)基組成與控制3.3.2 培養(yǎng)工藝與控制3.3.3 終點(diǎn)控制3.3.1 培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機(jī)鹽選擇劑誘導(dǎo)物1、碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其它有機(jī)物如甘油等對(duì)菌體生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會(huì)造成培養(yǎng)基的酸化。2、氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機(jī)氮源。不同工程菌對(duì)氮源利用能力差異很大，具有很高

14、的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機(jī)氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源3、無機(jī)鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)基因工程菌生長(zhǎng)提供必需的礦物質(zhì)。4、選擇劑 selective agent維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失。根據(jù)質(zhì)粒上的營(yíng)養(yǎng)缺陷或選擇性標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。選擇劑種類營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等抗生素作為選擇劑工程酵母菌：氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等，有時(shí)也是使用G418等抗性

15、。5、誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌：在細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的。Lac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。6、培養(yǎng)基組成對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營(yíng)養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定性高于合成培養(yǎng)基限制性基質(zhì)對(duì)基因工程菌的比生長(zhǎng)速率有不同影響。大腸桿菌對(duì)葡萄糖和磷酸鹽限制易發(fā)生質(zhì)粒不穩(wěn)定，有一些質(zhì)粒對(duì)氮源、鉀、硫等表現(xiàn)不穩(wěn)定。對(duì)于酵母，極限培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。培養(yǎng)基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。3.3.2 培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH溫度對(duì)工程菌發(fā)

16、酵的影響大腸桿菌和釀酒酵母生長(zhǎng)最低溫度為10大腸桿菌生長(zhǎng)最適溫度為37，最高溫度為45。釀酒酵母生長(zhǎng)最適溫度為30，最高溫度為40。溫度對(duì)工程菌發(fā)酵的影響生長(zhǎng)與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達(dá)包涵體，較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)。對(duì)于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。溫度控制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對(duì)菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：生長(zhǎng)期維持37，生產(chǎn)期提高溫度42。pH值對(duì)發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌

17、適宜pH為6.57.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.06.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長(zhǎng)和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長(zhǎng)速率下降，也抑制基因表達(dá)。pH值控制了解發(fā)酵過程中各個(gè)階段的適宜pH以后，需要進(jìn)一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來確定生長(zhǎng)最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達(dá)到最佳生產(chǎn)。3.溶解氧控制工程菌是好氧微生物，生長(zhǎng)過程需要大量氧。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長(zhǎng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個(gè)方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力考慮溶氧對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量3

18、.3.3 終點(diǎn)控制根據(jù)目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)模式而定。適宜的誘導(dǎo)時(shí)間：非常重要誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度：影響表達(dá)量，產(chǎn)物存在形式在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制。1、化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：lac、tac、T7等誘導(dǎo)時(shí)間：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌：IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷),誘導(dǎo)甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母：甲醇誘導(dǎo)。2、溫度誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：PL、PR啟動(dòng)子兩段培養(yǎng)發(fā)酵：誘導(dǎo)時(shí)間：菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期或稍后一些，升高溫度，合成產(chǎn)物。思考題（1）工程菌與宿主菌對(duì)培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？（2）影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？（3）工程菌發(fā)酵中，如何確定終點(diǎn)？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因

19、工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)3.2 基因工程菌的構(gòu)建技術(shù)3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與工藝控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.4.1 干擾素概述3.4.2 基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏3.4.3 干擾素的發(fā)酵工藝過程3.4.4 干擾素的分離純化工藝過程3.4.1 干擾素概述干擾素的種類干擾素的臨床應(yīng)用干擾素的生產(chǎn)工藝路線1、干擾素的種類概念：（interferon，IFN）機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細(xì)胞因子功能：干擾病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖分類：型：有IFN-和IFN-，其中IFN-有二十余個(gè)亞型，IFN-僅有一個(gè)亞型。型干擾素具有抑制病毒復(fù)制

20、、抗寄生蟲、抑制多種細(xì)胞增殖、刺激免疫細(xì)胞的殺傷活性、參與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用。型：只有IFN-，且只有一種亞型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物學(xué)活性為免疫調(diào)節(jié)作用。型：即IFN-1（IL-29）、IFN-2（IL-28a）和IFN-（IL-28b）。干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW：17-23 ku；pH：5.7-8.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附介質(zhì)。2、重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFN）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIF

21、N）多發(fā)性硬化癥rhuIFN3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFN-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1g IFN，需要3億ml人血白細(xì)胞來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性血漿人白細(xì)胞分離純化病毒誘導(dǎo)人白干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFN -n1/Wellferon, 批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：活性低，退出臨床應(yīng)用。Namalva培養(yǎng)合成干擾素分離純化病毒誘導(dǎo)多亞型混合干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝

22、：上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。工程菌構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)包涵體復(fù)性重組人干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（4 ）動(dòng)物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴(yán)格工程

23、菌CHO細(xì)胞系構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化重組人干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida）上市產(chǎn)品：IFN -2b/安福隆表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析3.4.2 基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫(kù)的建立與保藏1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素基因的克隆(RT

24、-PCR)制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA，PCR，基因連接質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測(cè)序：編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAA

25、AGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA1、基因工程假單胞桿菌菌

26、種建立第二步：表達(dá)載體構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽(yáng)性克隆獲得序列正確表達(dá)載體1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第三步：工程菌構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種2、基因工程菌的特性具有宿主菌的特征：細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0 mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為碳源。工程菌的特征：SmR、TcR、ApR具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學(xué)效價(jià)不低于2.0109 IU/L。3、菌種庫(kù)的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。傳代擴(kuò)增，凍干保藏原

27、始菌種庫(kù)主菌種庫(kù)工作菌種庫(kù)傳代擴(kuò)增，凍干保藏3.4.3 干擾素的發(fā)酵工藝過程工作菌種庫(kù)搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體收集1搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250 r/min，182h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。2種子罐培養(yǎng)接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30，pH7.0?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO為30%，34h，OD4.0。檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌3發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30，pH7.0，DO為30%。4h后：20，pH6.0，DO為60%

28、，56.5h。終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.01.0，5冷卻水快速降溫至15以下。檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查4菌體收集連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000 r/min離心收集。菌體保存：-20冰柜，不超過12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。思考題（1）1、干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何特點(diǎn)？2、干擾素發(fā)酵工段的關(guān)鍵控制點(diǎn)是什么，如何實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？3、根據(jù)現(xiàn)有工藝路線，提出研發(fā)仿制重組干擾素生產(chǎn)新工藝。3.4.4 干擾素的分離純化工藝過程1、干擾素分離工藝過程2、干擾素的純化工藝過程1、干擾素分離工藝過程菌體裂解預(yù)處理初級(jí)分離(1)菌體裂解裂解緩沖液：純化水，210（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA（乙二胺四乙酸 ），PMSF（苯甲基磺酰氟 ）。破碎20菌體：2厘米攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:210，攪拌，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:210,攪拌，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。沉淀作用離心連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/min收