093研實驗2大實驗

1、實驗二 蛋白酶抑制劑的明膠-聚丙烯酰胺凝膠電泳1一. 目的：1.學(xué)習(xí)和掌握蛋白酶抑制劑電泳基本原理及電泳技術(shù)。2.熟練掌握蛋白酶抑制劑電泳有關(guān)試劑配制的技術(shù)和制膠技術(shù)。2 二、原理：(一).聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）:是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide，簡稱Acr）甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N-methylenebisacrylamide,簡稱Bis）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。3常用的催化聚合方

2、法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合:加入催化劑過硫酸銨（NH4 ）2S2O3（即AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，這樣由于乙烯基“CH2=CH”一個接一個的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯(lián)，從而形成交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。氧氣對自由基有清除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進(jìn)行抽氣。光聚合:催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產(chǎn)生自由基，催化聚合反應(yīng)。一般光照23小時即可完成聚合反應(yīng)。 45聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈間縱橫交錯，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠

3、具有分子篩性能。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運動，使凝膠具有良好的抗對流作用。長鏈上富含酰胺基團(tuán)，使聚丙烯酰胺成為穩(wěn)定的親水凝膠。該結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點使得聚丙烯酰胺特別適于作區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)。6 聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度（T）和交聯(lián)度（C）決定。 每100mL凝膠溶液中含有的單體(Acr,a)和交聯(lián)劑(Bis,b)總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T表示。 凝膠溶液中，交聯(lián)劑(Bis)占單體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis)總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，用C %表示。7改變凝膠濃度（T）和交聯(lián)度（C），可獲得不同密度、粘度、彈性、機(jī)械強(qiáng)度和孔徑大小的凝膠，以適應(yīng)各種樣

4、品的分離。一般常用7.5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，用2.4%的分離核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸相對分子質(zhì)量的不同，適用的濃度也不同。 8 富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。選擇T和C的經(jīng)驗公式是：C = 6.50.3T 此式可用于計算T為520時的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1，當(dāng)C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4時，有效孔徑最小，C大于或小于4時，有效孔徑均變大，C大于5時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6和3。9 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰

5、胺的濃度可以在330之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDSPAGE電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如1020的凝膠常用于SDSPAGE電泳的分離膠。 配稱30的丙烯酰胺水溶液在4下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內(nèi)滲現(xiàn)象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。10 由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點，因而四十年來得到廣泛的

6、應(yīng)用，目前尚無更好的支持介質(zhì)能夠取代它。其主要的優(yōu)點有：可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：109 1012 mol/L。由于聚丙烯酰胺凝膠是由CC鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基CONH2 ，沒有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時不會產(chǎn)生“電滲”。由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。還可以用作固定化酶的惰性載體。 1

7、1(二).影響電泳遷移率的因素電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交界面的紙長為20cm，測得的電位降為200V，那么電場強(qiáng)度為200V/20cm10V/cm。當(dāng)電壓在500V以下，電場強(qiáng)度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上，電場強(qiáng)度在20-200V/cm時為高壓電泳。電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點的遷移率加速，因此省時，但因產(chǎn)生大量熱量，應(yīng)配備冷卻裝置以維持恒溫。12溶液的pH值 溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子，它是既有酸性基團(tuán)（-COOH），又有堿性基團(tuán)（-

8、NH2）的兩性電解質(zhì)，在某一溶液中所帶正負(fù)電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時，蛋白質(zhì)在電場中不再移動，溶液的這一pH值為該蛋白質(zhì)的等電點（Isoelctric point，pI）。若溶液pH處于等電點酸側(cè)，即pHpI，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。若溶液pH處于等電點堿側(cè)，即pHpI，則蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，向正極移動。溶液的pH離pI越遠(yuǎn)，質(zhì)點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。13溶液的離子強(qiáng)度 電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點遷移率的降低。其原因是帶電質(zhì)點吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個與運動質(zhì)點符合相反的離子氛（ionic

9、atmosphere），離子氛不僅降低質(zhì)點的帶電量，同時增加質(zhì)點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響質(zhì)點的帶電量，改變泳動速度。離子的這種障礙效應(yīng)與其濃度和價數(shù)相關(guān)?？捎秒x子強(qiáng)度I表示。14式中S表示溶液中離子種類，Ci和Zi分別表示每種離子的摩爾濃度與化合價。最常用I值在0.02-0.2之間。15電滲 在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲(Electro-osmosis)。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維

10、素吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點原來在電場中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。165.焦耳熱 電泳過程中釋放的熱量與電流的平方成正比，當(dāng)電極緩沖液中離子強(qiáng)度增加時，電流強(qiáng)度會隨之增加，這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時會燒斷濾紙或融化瓊脂糖凝膠支持物。6.篩孔 支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快；反之，則泳動速度慢。除上述影響泳動速度的因子外，溫度和儀器裝置等對泳動速度的影響也應(yīng)考慮。17(三).蛋

11、白酶抑制劑電泳活性染色的原理： 分離純化蛋白酶抑制劑時，常采用對其靶蛋白酶的抑制活性來進(jìn)行檢測和追蹤。由于植物材料中蛋白酶抑制劑含量較少，而測定抑制活性的方法復(fù)雜、費時，需要人工合成的特殊底物，因此不太方便。 根據(jù)蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶的作用特點，采用明膠PAGE，分離膠中加入0.5% 明膠作為靶蛋白酶的底物，電泳后膠板（含明膠底物）在靶蛋白酶進(jìn)行酶解時，除了蛋白酶抑制劑存在處的明膠不被酶解，膠板中其他位置的明膠均被蛋白酶水解。酶解后再經(jīng)水沖洗干凈凝膠，然后再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色，顯色帶（蛋白帶）為靶蛋白酶抑制劑的作用效果（抑制劑抑制蛋白酶活性從而使明膠不被水解部位）。采用不同靶蛋白酶可以

12、檢測同一植物中不同的蛋白酶抑制劑。18三. 實驗材料胰蛋白酶抑制劑：來自紅豆提取液，經(jīng)80鹽析的上清液、Sephadex-G100柱層析。標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶抑制劑（國產(chǎn)）。大概蛋白酶抑制劑的點樣范圍：抑活為110U都可以出帶。電泳的樣品：0.51mL/樣品/班（15l/孔）19四. 儀器設(shè)備 1.DDY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ23A型電泳槽（垂直平板電泳槽）2.恒溫箱3.水浴鍋：調(diào)37或504.冰箱5.脫色搖床6.移液管或移液器5mL(1)、1mL(2)、0.1mL（1）7.微量注射器50uL（1）20五. 玻璃器皿（以組為單位）100 mL燒杯（3），吸管（1）、玻棒（1）， 濾紙（36），

13、試劑瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等）、培養(yǎng)皿。21六. 實驗試劑（一）試劑準(zhǔn)備：丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨、濃HCl、Tris、氫氧化鈉、蔗糖、冰醋酸、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R250、NaCl、CaCl2、甲醇、甲醛、明膠、溴酚藍(lán)、胰蛋白酶（國產(chǎn)）22(二) 電泳部分的凝膠制備方法1、30%凝膠貯液：取60g丙烯酰胺（Acr）、1.6g甲叉雙丙烯酰胺(Bis)。先用約100 mL蒸餾水溶解，如溶解不了,可加熱30oC-50oC溶解,再用量筒定容至200mL，然后過濾，后置于棕色瓶。4下保存?zhèn)溆?。全?00mL2、10%過硫酸銨(AP)溶液：取2g過

14、硫酸銨溶解后，定容至20mL，現(xiàn)配現(xiàn)用.3、1 mol/L HCl 500mL：在通風(fēng)櫥取濃HCl 42 mL，加蒸餾水至500 mL。4、分離膠緩沖溶液（1.5mol/L TrisCl緩沖液，pH8.8）：取36.3g Tris（三羥甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/L HCl溶液約96 mL ，調(diào)pH至8.8，定容至200mL。 全班200mL235、濃縮膠緩沖液(0.5mol/L TrisHCl緩沖液，pH6.8)：取6g Tris（三羥甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/L HCl溶液約40 mL，調(diào)pH至6.8，定容至100mL。 6、電極緩沖液（0.05 mol/L Tris0.38

15、4 mol/L甘氨酸緩沖液，pH8.3）：取Tris（三羥甲基氨基甲烷）6g、28.8g甘氨酸(氨基乙酸)，加水溶解后,測定pH8.3，定容至。用時稀釋倍。全班5000mL工作液7、25明膠：稱取25g明膠，加入10mL蒸餾水，溶解混勻后低溫保存。 (如果難以溶解可于37水浴中攪拌溶解)。8、0.5溴酚藍(lán)指示劑：配50mL。9、10% 四甲基乙二胺（TEMED）20mL。24(三) 酶解和脫酶部分的試劑制備方法（電泳過程中再配）。1、0.5 mol/L HCl：全班配200 mL2、0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5（內(nèi)含0.2mol/LNaCl， 0.01mol/LCaCl2）

16、： 取6.05 g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、80.6mL 0.5 mol/L鹽酸, 加入12.5g NaCl和1g CaCl2，加水定容至1000mL，用試紙檢測pH7.5。3、100 U/mL的胰蛋白酶液0.2 mg/mL： 稱取20mg胰蛋白酶，用0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5（內(nèi)含0.2mol/LNaCl，0.01mol/LCaCl2）定容到100mL。25(四) 染色和脫色部分的試劑制備方法（電泳過程中再配）。1、考馬斯亮藍(lán)R250染色液（0.1%考馬斯亮藍(lán)-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考馬斯亮藍(lán)R250，加入450 mL 甲醇、100mL冰乙酸，用水定容

17、至1000 mL。過濾后使用。2、0.5mol/L NaCl脫色液，2000mL。3、 5%氨水：將氨水原液和水以1：4的比例稀釋。26七實驗步驟（一）、電泳凝膠的制作1、清洗玻璃板;2、在塑料膠條兩面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄臟玻璃板）；3、安裝好電泳槽（玻璃板）；4、用小燒杯按下表1配封膠液，用滴管滴加于封口槽處，靜置約5-10分鐘直到凝固。5、加入水于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；如果漏水,要重裝。276、用小燒杯按下表1配下層膠（分離膠），膠濃度13，混勻，灌膠，高度離梳子約11.5cm，然后覆蓋一層水，凝膠時間為15-30分鐘，膠與水分層，傾倒去水。7、小燒杯按上表配上層

18、膠（濃縮膠），膠濃度，混勻，灌膠，插入梳子；8、在凝膠過程中，液面下降，要補充膠液，凝膠時間約10-20分，凝好膠，拔掉梳子；9、加入稀釋的電極緩沖液,浸泡至上槽（低玻璃面）,但不能高過下槽（低玻璃面）,注意不能漏水。2829（二）、電泳的過程1、點樣前，樣品要加20蔗糖20ul以增加比重，同時加0.05的溴酚蘭10ul指示劑，按下表2點樣，用微量注射器點樣，每點1個樣品，都要清洗微量注射器，注意不要交叉污染。2、將電泳槽上槽（低玻璃面）接（），下槽（高玻璃面）接（）， 恒電壓電泳： 濃縮膠， 100V ，約 1h ；分離膠， 160V ，約 3-4h。指示劑離下面膠剩1cm左右停止電泳。3、剝膠。注意，不要把膠弄碎。30（三）、電泳后的活性染色1、電泳完畢，取出膠板置于培養(yǎng)皿中，用去離子水沖洗數(shù)次，將膠板浸在含0.2 mg/mL胰蛋白酶0.05mol/LTris-HCl，pH7.5的緩沖液中，37下保溫酶解30min。2、室溫下用水漂洗酶解過的膠板5次。3、漂洗完畢，用考馬斯亮藍(lán)R-250 50染色0.5h，用5%氨水于搖床上進(jìn)行脫色5min至背景清晰,到掉氨水，用水洗干凈氨水。4、把膠置于照相板上進(jìn)行拍照。31八 注意事項凡士林不要涂太多。封好底加水檢測是不是漏水，漏水重做。加分離膠后記得加入一層水，但不要沖歪了分離