遺傳學(xué)課件12第十二章(遺傳工程)

1、遺傳學(xué)課件12第十二章（遺傳工程）廣義生物工程：細(xì)胞工程、基因工程、酶工程、發(fā)酵工程第一節(jié) 基因工程概述生物工程（biological engineering）是指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。狹義生物工程：基因工程基因工程定義：利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。 基因工程的特點(diǎn)1、跨越天然物種屏障，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物、植物、微生物間的遺傳物質(zhì)交換。2、只定向改變一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)性狀，而不改變品種的其他特性。3、可以人為控制基因的表達(dá)。植物

2、表達(dá)載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 篩選抗生素抗性細(xì)胞 再生抗性植株整合PCR, Southern雜交, 原位雜交轉(zhuǎn)錄RT-PCR, 定量PCR, Northern雜交翻譯Western雜交 生物檢測(cè)遺傳分析基本技術(shù)流程：目的基因克隆第二節(jié) 基因的分離基因克隆通常包括三個(gè)步驟：1）目標(biāo)DNA片段（基因）的分離；2）目標(biāo)基因克隆到載體上；3）載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中大量復(fù)制。一、工具酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶（限制性酶）（restriction enzyme） 在識(shí)別雙鏈DNA分子中某些特定核苷酸序列的基礎(chǔ)，切割DNA雙鏈的內(nèi)切酶。細(xì)菌（宿主）本身的DNA通過甲基化酶的作用，使DNA得到修飾，免遭自身限制

3、性內(nèi)切酶的破壞。胞嘧啶5甲基胞嘧啶甲基化 細(xì)菌細(xì)胞具有防御異源遺傳物質(zhì)（病毒）的進(jìn)入的能力，異源DNA分子進(jìn)入后，會(huì)被限制酶識(shí)別并降解，這個(gè)過程稱為限制。限制修飾系統(tǒng)：型限制性內(nèi)切酶：酶切部位有特異性，能識(shí)別DNA分子上特定的DNA序列。型限制性內(nèi)切酶：酶切部位沒有特異性，隨機(jī)切割雙鏈DNA分子。EcoB和EcoK型限制性內(nèi)切核酸酶（型酶）具有特異的識(shí)別位點(diǎn)，這種識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱的。 三種限制性內(nèi)切酶型酶有幾個(gè)基本特性 在DNA分子上有特異識(shí)別和切割的序列部位，使被切割的DNA分子形成單鏈的斷裂； DNA分子上兩個(gè)單鏈斷裂的部位通常不是直接相對(duì)的； 斷裂結(jié)果所形成的DNA片段常具有堿基互補(bǔ)的單

4、鏈尾巴（粘性末端），使其能夠重新連接； 內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個(gè)不同的酶催化所完成，即該類內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的，只需要Mg2+來激活，不需要ATP輔助因子。表12-1 不同限制酶的識(shí)別、切割和修飾位點(diǎn) echo-r-one回紋對(duì)稱序列（二）DNA連接酶 能催化DNA中相鄰的3 OH和5 磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來。在分子克隆中使用的DNA連接酶有兩種。即大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶。 兩種DNA連接酶都不能催化單鏈DNA之間的連接反應(yīng)，被連接的DNA鏈必須是雙鏈DNA分子的一部分。T4 DNA連接酶還可以催化二個(gè)具有平齊末端的雙鏈DNA片段

5、之間的連接反應(yīng)，而大腸桿菌連接酶一般不具有這種活性。（三）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是一類以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，所以又稱為依賴于RNA的DNA聚合酶。 反轉(zhuǎn)錄酶在遺傳工程中的主要用途是以mRNA為模板合成cDNA 。cDNA文庫代表的是某一特定細(xì)胞，或組織，或某一發(fā)育階段的表達(dá)的基因，而基因組文庫代表的是基因組中所有的基因。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） PCR反應(yīng)在一種混合液中進(jìn)行（PCR mixture）包括四種主要成分：兩個(gè)引物（一般為20 bp）；模板DNA；

6、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸。聚合酶是Taq酶（AmpliTaq polymerase，在95甚至更高的溫度下活性穩(wěn)定）。PCR反應(yīng)已經(jīng)自動(dòng)化，在PCR儀（thermocycler）上進(jìn)行?；具^程：通過高溫，雙鏈DNA變成單鏈DNA變性；通過降低溫度，使引物和摸板配對(duì)退火;利用耐熱DNA聚合酶,合成產(chǎn)物DNA延伸。 變性溫度：93-94 ， 30-60秒 退火溫度：36-60 , 30-60秒 延伸溫度：72 , 1.5-2分循環(huán)30-40次;最后72 補(bǔ)齊10分鐘。循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)121252532102101024152153276820220104857625225335

7、54432302301073741824表12-2 PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系 圖12-6 在紫外燈下觀察到的瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶二、載體(vector)（一）重組DNA技術(shù)重組DNA（recombinant DNA）主要指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。 重組DNA的步驟（1）從細(xì)胞或組織獲得DNA并純化；（2）用限制酶切割DNA；（3）將獲得的限制片段連接到載體上。（4）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)重組DNA分子復(fù)制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子，稱為克隆；（5）克隆的DNA分子可以從宿主細(xì)胞中回收，純化；

8、（6）克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)。圖12-5 重組DNA技術(shù)流程（二）載體(vector)作為載體DNA分子，必須儲(chǔ)備的4個(gè)條件：（1）具有復(fù)制原點(diǎn)，在宿主細(xì)胞中不僅能獨(dú)立地自我復(fù)制，而且能帶動(dòng)攜帶的外源基因一起復(fù)制。（2）具有多克隆位點(diǎn)，即具有多種限制性酶切位點(diǎn)，且每一種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)。（3）至少具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因。如抗菌素的抗性基因或某種酶的基因。（4） 分子量小，多拷貝，易于操作。 1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。外源DNA片段小于10kb圖12-8 質(zhì)粒PUC18的結(jié)構(gòu)及

9、多克隆位點(diǎn) 互補(bǔ)： 互補(bǔ)是指大腸桿菌-半乳糖苷酶的兩個(gè)無活性片段組合成為功能完整的酶的過程。受體片段：酶的C端片段，一般存在于宿主細(xì)胞。 供體片段：酶的N端片段，一般存在于質(zhì)粒載體。 供體片段+受體片段 有活性 質(zhì)粒載體含有 LacZ基因的N端編碼序列，在編碼區(qū)含有多克隆位點(diǎn)，不影響酶的活性，選擇含有-半乳糖苷酶C端片段的宿主細(xì)胞。 在含有X-gal（5-溴-4-氫-3-吲哚- D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基中形成蘭色菌落，但如果外源DNA插入到多克隆位點(diǎn)，將絕對(duì)地產(chǎn)生不具有互補(bǔ)功能的N端片段產(chǎn)生，菌斑為白色。圖12-6重組質(zhì)粒的藍(lán)白斑篩選 2、病毒載體噬菌體載體可以接受1523kb的外源DNA片段圖

10、12-10利用噬菌體為載體克隆外源DNA的策略 3、克隆大片段DNA的載體 黏粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體載體 。圖12-11黏粒載體pJB8圖譜 黏粒載體（cosmid）柯斯質(zhì)粒噬菌體DNA包裝成功噬菌體時(shí)所必需的。質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)可以接受1545kb的外源DNA細(xì)菌人工染色體（BAC）可以克隆300kb左右片段酵母人工染色體（YAC）YAC載體可以插入大片段的DNA（1-2Mb） 三、基因的分離（一）從基因文庫中分離基因 基因文庫：是由單一來源的特定組織或器官的DNA或cDNA片段匯總形成的克隆群體。 1、基因庫的構(gòu)建基因組文庫：全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的一個(gè)重組D

11、NA群體 。cDNA文庫：是以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補(bǔ)DNA（cDNA），將獲得的雙鏈cDNA與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，而構(gòu)建成的基因庫。 cDNA文庫與基因組文庫的不同基因組文庫代表了基因組中的所有基因，而cDNA文庫僅代表某一特定細(xì)胞類型，某一組織，或某一胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)序列。2從基因庫中分離特定的克隆序列(基因)（1） DNA探針探針是待篩選的目的基因或克隆的一段互補(bǔ)的核酸序列。利用DNA探針可以從基因庫中篩選特定的克隆通常探針用同位素標(biāo)記，但也可使用熒光標(biāo)記或顏色反應(yīng)標(biāo)記探針。探針可以有多種來源，如果篩選植物基因，探針可以來源于植物本身，也可以來源

12、于異源植物、動(dòng)物中的同類基因的保守序列。 (2) 篩選文庫 （3）陽性克隆的分析與鑒定從文庫中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析和功能預(yù)測(cè)。，確定測(cè)定的核酸序列是不是所需要的基因，采用適當(dāng)?shù)能浖A(yù)測(cè)它具有什么功能。 （二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因T-DNA 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA（Plasmid rescue; IPCR; Tail PCR)利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫中釣取基因基因功能的驗(yàn)證（三）PCR擴(kuò)增基因（四）人

13、工合成基因第三節(jié) 外源基因的導(dǎo)入一、重組DNA導(dǎo)入原核生物 1CaCl2處理轉(zhuǎn)化： 將細(xì)菌細(xì)胞用冰上預(yù)冷的CaCl2處理，然后轉(zhuǎn)移到42的條件下處理90秒。CaCl2處理轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不清楚，可能是CaCl2處理破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁，使游離的DNA分子被攝入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化頻率大概是千分之一。2電激轉(zhuǎn)化（electroporation）是目前常用的一種轉(zhuǎn)化方式。在電轉(zhuǎn)化儀施加的強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，使受體細(xì)胞細(xì)胞壁具有可逆的電穿孔，以使DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)行電轉(zhuǎn)化操作時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞和DNA分子放在帶有電極的小室中，通過小室（chamber）施加電脈沖，使細(xì)胞壁穿孔，然后DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化的頻率通常

14、是10-610-9，因質(zhì)粒的大小而異。3結(jié)合（conjugation）結(jié)合是原核生物細(xì)胞與細(xì)胞接觸而進(jìn)行遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一種自然過程。二、植物表達(dá)載體作為植物基因轉(zhuǎn)化的載體，必須具有兩種功能：（1）能作為媒介將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞中去，并且整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA上；（2）能提供被寄主細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識(shí)別的DNA序列，即啟動(dòng)子和復(fù)制子起始位點(diǎn)，以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。 Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，約有150200kb。各種不同類型的Ti質(zhì)粒都具有T-DN

15、A區(qū)、毒性區(qū)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)和冠癭堿分解位點(diǎn)(圖12-13)。其中以T-DNA區(qū)和毒性區(qū)在植物轉(zhuǎn)化中最為重要。 T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列（分別稱為左邊界序列和右邊界序列）。 T-DNA攜帶的致瘤基因?qū)嶋H上就是一些與激素合成有關(guān)的基因，稱為致瘤基因，T-DNA的右端序列對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)具有重要意義。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物細(xì)胞的致瘤基因除去，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。 T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA): 是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。Vir區(qū)

16、段總長度大約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。毒性區(qū)中各個(gè)位點(diǎn)的表達(dá)情況可以分為兩種：一種是組成型表達(dá)，即在無植物誘導(dǎo)分子存在下依然保持一定的表達(dá)水平；另一種是植物誘導(dǎo)型表達(dá)，即這些基因的表達(dá)必須在土壤農(nóng)桿菌感染植物受傷組織時(shí)，植物細(xì)胞分泌的信號(hào)分子作用下才能啟動(dòng)表達(dá)。Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。三、外源基因?qū)胫参锓巧镙d體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化:種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，如花

17、粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉后的子房等；直接轉(zhuǎn)化是采用物理或化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，如基因槍法等。高等植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法可以劃分為兩類：一類是非生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，另一類是生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 三、外源基因?qū)胫参铮ㄒ唬┺r(nóng)桿菌介導(dǎo)法1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化需要具備的條件（1）高效的植株再生體系;（2）受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。一般認(rèn)為受體細(xì)胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)，只有處于分裂期的細(xì)胞，在DNA的復(fù)制過程中，T-DNA才能插入植物基因組；（3）應(yīng)具有有效的選擇系統(tǒng)。必須有一個(gè)理想的選擇方法將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇出來，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，才能保證獲得轉(zhuǎn)基因

18、植株；（4）穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。2、轉(zhuǎn)化方法F1. 共培養(yǎng)2. 在選擇培養(yǎng)基上篩選3. 篩選獲得的抗性愈傷 5. 胚萌發(fā)成苗6. 轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4. 抗性愈傷分化成胚狀體3、選擇系統(tǒng)抗生素抗性基因，如NPTII基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因），能分解卡那霉素等抗生素。其它選擇標(biāo)記基因，如抗除草劑基因，報(bào)告基因如：GUS基因(-葡糖苷酸酶基因) 、GFP基因等。4影響轉(zhuǎn)化的因素農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化有嚴(yán)格的寄主限制，雙子葉植物比單子葉植物容易轉(zhuǎn)化。同一種植物不同的基因型轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有所不同。農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度、植物材料的生理狀態(tài)、預(yù)培養(yǎng)處理等都對(duì)轉(zhuǎn)化效率有影響。大量的研究表明，在培養(yǎng)農(nóng)桿菌

19、或共培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入微量的乙酰丁香酮（acetosyringone）能明顯提高轉(zhuǎn)化效率。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)移的外源基因優(yōu)點(diǎn)：與受體基因組整合有一定的方向性，大多數(shù)是單位點(diǎn)整合，整合的外源基因基本保持其完整性。（二）基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法（gene gun），又稱生物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法，是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：無宿主限制，可以對(duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。對(duì)于不能通過體細(xì)胞再生植株的基因型，可以通過基因槍轟擊莖尖實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，是一種非基因型依賴型的轉(zhuǎn)化技術(shù)； 靶受體類型十分廣泛，幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細(xì)胞； 易于操作。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化

20、的外源基因以多拷貝居多易導(dǎo)致基因沉默，實(shí)驗(yàn)成本較高等?；驑屴D(zhuǎn)化原理 基因槍轉(zhuǎn)化前(A)及轉(zhuǎn)化后(B)的主要部分示意圖 第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、 分子檢測(cè)1、PCR檢測(cè)圖12-16 轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對(duì)照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株）2、Southern雜交M 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4 -6.6 -4.4 -2.3 -2.0 -圖12-20轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(cè)（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陽性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株） 3、Northern雜交4、Weste

21、rn雜交二、生物學(xué)性狀鑒定圖12-18 轉(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時(shí)被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，右圖為非轉(zhuǎn)基因棉）第五節(jié) 基因工程的應(yīng)用 一、基因工程的應(yīng)用 1、基因工程是生物科學(xué)基礎(chǔ)研究的重要手段2、利用基因工程改良植物轉(zhuǎn)基因抗蟲作物與抗除草劑作物 ：自從1996年轉(zhuǎn)基因作物在生產(chǎn)上使用以來，轉(zhuǎn)基因作物的面積迅速擴(kuò)大，2003年轉(zhuǎn)基因抗蟲和抗除草劑的作物分別達(dá)到1000萬和5000萬公頃左右。美國的轉(zhuǎn)基因棉花達(dá)到總播種面積的80%左右，全球的轉(zhuǎn)基因棉花已達(dá)到50%的面積。 改善植物品質(zhì)和抗逆性全世界每年都有超過50萬的兒童因?yàn)槿狈S生素A而導(dǎo)致完全或不完全失明，傳統(tǒng)的耕作方式并不能提高農(nóng)作物的

22、維生素含量，每年發(fā)達(dá)國家都投入巨額資金來開展有關(guān)的研究計(jì)劃。新的轉(zhuǎn)基因稻米品種富含維生素A。經(jīng)過多年的研究，科學(xué)家已經(jīng)把分離出的三種功能基因（兩種來源于水仙花，一種來源于微生物體）嫁接到稻谷中，經(jīng)過基因修飾的稻谷體內(nèi)能合成大量的維生素前體胡蘿卜素,而且還擁有一個(gè)漂亮的外表：它的果實(shí)呈金黃色。這種“黃金”水稻對(duì)解決熱帶地區(qū)兒童的維生素缺乏癥意義尤為重大。4、基因工程工業(yè)（1）利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物生物制藥改變了傳統(tǒng)制藥的原料、工藝和生產(chǎn)方式，使產(chǎn)值效應(yīng)呈指數(shù)增長。生物藥多為人體功能物質(zhì)，例如治療侏儒癥的人生長素，常規(guī)方法是從腦下垂體提取，治療一個(gè)病人需50具尸體；糖尿病的特效藥胰島素是從?；蜇i的胰腺中提取，100原料只生產(chǎn)4-9g，一位患者就需40-50頭豬的胰臟。隨著基因表達(dá)調(diào)控研究的深入，利用植物為生物反應(yīng)器來產(chǎn)生蛋白類藥物和疫苗，可以提高產(chǎn)量而且大大降低生產(chǎn)成本。3、利用基因工程改良動(dòng)物克隆動(dòng)物的成功（