《細(xì)胞生物學(xué)》課件3 R 細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法概 述形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法 細(xì)胞組分分析方法 細(xì)胞工程技術(shù)（細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)） 1一、光學(xué)顯微鏡（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡 顯微鏡的分辨率：指顯微鏡下能夠分辨清楚的兩點(diǎn)之間的最小距離。分辨率的高低與分辨距離成反比。D0.61/N.sin/2 為成像的光的波長(zhǎng)，N為樣品周圍介質(zhì)的折射率，/2是進(jìn)入物鏡光錐的半角。光學(xué)顯微鏡的最小分辨距離為 0.2微米 （油鏡）,肉眼的分辨率是0.2 mm.第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2提高分辨率的方法：油鏡+香柏油光波波長(zhǎng)合適的目鏡特殊的顯微鏡3（二）相差和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡成像的特點(diǎn)： 將透過標(biāo)本的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?/p>

2、（即明暗對(duì)比），觀察活細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。 4相差顯微鏡的主要構(gòu)件相板物鏡標(biāo)本聚光鏡環(huán)狀光欄光源5相差顯微鏡的光路圖（工作原理）光的衍射：光的干涉： 6 相差顯微鏡成像7微分干涉顯微鏡8微分干涉顯微鏡成像9小結(jié)相差顯微鏡：利用物體（如細(xì)胞）不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）的差別，經(jīng)過帶有環(huán)狀光欄的聚光鏡和帶有相板的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀察的顯微鏡。 用途：觀察活細(xì)胞。 10（三）熒光顯微鏡技術(shù)11熒光顯微鏡成像的原理光源 激發(fā)光與發(fā)射光：短波長(zhǎng)光(510nm, 熒光）激發(fā)光濾片雙色鏡（分色鏡）熒光物鏡含熒光素的標(biāo)本發(fā)射光濾片12熒光顯微鏡下的細(xì)胞照片13

3、（四）激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)14成像原理15尤適用于做蛋白質(zhì)定位的分析，特別是共定位的分析16二、電子顯微鏡技術(shù)概述： 采用電子束作為光源 分辨率： 2-4 A 放大倍數(shù)： 可達(dá)100多萬(wàn)倍 觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)（超微結(jié)構(gòu)）： 17電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM光鏡TEM透射電鏡200nm100nm0.1nm可見光（400-700） 紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡石英玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差18電鏡上述特征的

4、功能電子束波長(zhǎng)很短可提高分辨率電磁透鏡可使電子偏轉(zhuǎn)可放大高真空避免空氣中的分子使電子散射熒光屏電子束不可見，但是轟擊熒光屏可使屏幕上出現(xiàn)圖像液晶屏19電子束成像的原理 根據(jù)成像的原理與功能不同，電鏡可分為兩類，透射電鏡與掃描電鏡。電子束與樣品作用可產(chǎn)生： 透射電子、二次電子、散射電子、x射線等20透射電鏡與光鏡光路圖比較21透射電子顯微鏡的基本構(gòu)造22超薄切片技術(shù)23超薄切片過程24超薄切片電子染色超薄切片為什么要進(jìn)行電子染色？ 常用的固定劑：OsO4, 戊二醛、KMnO4常用的電子染色劑： 鉛鹽：染蛋白質(zhì) 醋酸鈾：染核酸25電子染色劑(1) 醋酸雙氧鈾 可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，以提高核酸、

5、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維成分的反差為主，對(duì)膜的染色效果較差。(2) 鉛鹽類染色劑 有全能染色劑之稱。它可與細(xì)胞內(nèi)的核蛋白及糖元結(jié)合，亦可大大提高細(xì)胞膜系統(tǒng)與脂類物質(zhì)的反差，幾乎可以浸染細(xì)胞內(nèi)的所有成分。其缺點(diǎn)是具有一定的毒性，極易與空氣中的 CO 2 結(jié)合產(chǎn)生碳酸鉛沉淀而污染切片。 26負(fù)染色技術(shù)制樣過程：染料：磷鎢酸 醋酸雙氧鈾27冷凍蝕刻電鏡技術(shù)在腐蝕性溶液中除去生物材料，復(fù)型經(jīng)重蒸水多次清洗后，撈在載網(wǎng)上作電鏡觀察 28電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)、 電子衍射技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)相結(jié)合而形成的一門研究生物大分子、病毒或核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的一門技術(shù)。B19 病毒29低溫電鏡技術(shù)

6、 是在電鏡三維重構(gòu)技術(shù)上發(fā)展起來的，其樣品不經(jīng)過固定、染色和干燥，直接被包在100nm厚的冰膜中，在電鏡內(nèi)-160攝氏度低溫下利用相位襯度成像。該技術(shù)不僅更真實(shí)的展示出生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，而且還具有更高的分辨率。 30掃描電鏡成像原理31掃描電鏡32掃描電鏡樣品的制備取材固定臨界點(diǎn)干燥噴鍍一層金膜上樣觀察333 掃描隧道顯微鏡與原子力顯微鏡特性: 掃描探針顯微鏡功能：具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)可在真空、液體、大氣條件下工作非破壞性測(cè)量34掃描隧道電子顯微鏡成像35掃描隧道電子顯微鏡成像的照片36思考？人紅細(xì)胞在三種類型顯微鏡下37第二節(jié) 細(xì)胞及其組分的分析方法超離心技術(shù)細(xì)胞

7、器與生物大分子的分離細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞組分的分布及其含量免疫技術(shù)檢測(cè)特異抗原的分布原位雜交技術(shù)與原位PCR定位特異核酸序列 的在細(xì)胞內(nèi)的分布放射自顯影技術(shù)可對(duì)動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行定位流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定含量、計(jì)數(shù)、分離38一、超離心技術(shù)離心機(jī)類型：相對(duì)離心力大小的計(jì)算公式：RCF=11.2R（r/min/1000）2R代表轉(zhuǎn)子的半徑, r/min代表的是轉(zhuǎn)速。 超離心技術(shù)（制備超速離心與分析超速離心） 差速離心： 密度梯度離心： 39超速離心技術(shù)40密度梯度離心1.速度沉降：主要用于分離密度相近而大小不一的組分。離心前，將要分離的細(xì)胞勻漿物放置在蔗糖濃度梯度溶液的上層，各種細(xì)胞組分根據(jù)它們的大小以不同

8、的速度沉降，形成不同的沉降帶，然后分別收集不同沉降帶中的組分，用于分析。2.等密度沉降：用于分離不同密度的細(xì)胞組分。細(xì)胞組分在連續(xù)梯度的高密度介質(zhì)中經(jīng)離心力場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間的作用沉降或漂浮到與自身密度相等的位置，形成不同的密度區(qū)帶。41二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法（一）概念：（四）顯色方法孚爾根反應(yīng)， PAS 反應(yīng)化學(xué)方法 詹納斯綠染線粒體 蘇丹 III染脂肪滴物理方法 溴化乙錠染DNA考馬斯亮藍(lán)染蛋白質(zhì)42考馬斯亮藍(lán)染色的原理 考馬斯亮藍(lán)分為R-150、R-250、R-350、G-250等。其中R-350最為靈敏，R為紅藍(lán)色，G為綠藍(lán)色。R-250和G-250的區(qū)別請(qǐng)參考這里。R-250即三苯基甲

9、烷，每個(gè)含有兩個(gè)SO3H基團(tuán)，偏酸性，與氨基黑一樣也是結(jié)合到的堿性基團(tuán)上 43三、特異蛋白抗原的定位與定性（1）概念：（2）優(yōu)點(diǎn)（與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相比）特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位性強(qiáng) 應(yīng)用廣泛，現(xiàn)在多采用熒光抗體（一）免疫熒光技術(shù)44（3）免疫細(xì)胞化學(xué)常用方法細(xì)胞的特異抗原抗原抗體復(fù)合物（直接免疫熒光）標(biāo)記的相應(yīng)抗體細(xì)胞的特異抗原一級(jí)抗體（特異） 抗原一抗二抗復(fù)合物二級(jí)抗體（通用、已標(biāo)記）（間接免疫熒光）45抗體標(biāo)記法熒光抗體酶標(biāo)抗體鐵蛋白法免疫膠體金法放射性同位素標(biāo)記抗體法46四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（分子）探針的標(biāo)記：雜交過程原位PCR引物PCR過程47細(xì)胞流式儀的工作原理48細(xì)

10、胞流式儀的工作原理光源發(fā)射激光（激發(fā)光）通過單個(gè)細(xì)胞收集單個(gè)細(xì)胞發(fā)出的熒光和折射光電腦分析對(duì)該細(xì)胞充電偏轉(zhuǎn)盤調(diào)控該運(yùn)動(dòng)方向分開收集49第三節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)50細(xì)胞培養(yǎng)的名詞術(shù)語(yǔ)原代培養(yǎng)：將動(dòng)植物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，或直接將單個(gè)細(xì)胞給予必要的生長(zhǎng)條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)與繁殖。傳代培養(yǎng)：無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入另一個(gè)培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)都叫傳代培養(yǎng)。細(xì)胞系：原代培養(yǎng)傳代10次后即成細(xì)胞系?？煞譃橛邢藜?xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系。細(xì)胞克?。簭囊粋€(gè)單一細(xì)胞通過有絲分裂而發(fā)展起來的細(xì)胞群體。細(xì)胞株：通過選擇法或克隆法從細(xì)胞系獲得的

11、有特殊標(biāo)志的細(xì)胞。51二、細(xì)胞工程（一）細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體技術(shù)概念：分類：促融合因子：同核融合細(xì)胞與異核融合細(xì)胞：52單克隆抗體技術(shù)53（三）顯微操作技術(shù)與動(dòng)物克隆概念：應(yīng)用： 核移植 顯微解剖 顯微注射5455（一）熒光漂白恢復(fù)技術(shù)fluorenscene recovery after photobleaching, FRAP)利用高能量激光束的照射使細(xì)胞特定區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，通過非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或者胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)到漂白區(qū)域，從而使光漂白區(qū)的熒光恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)1: FRAP with the LSM 510 EGFP-成肌細(xì)胞的EGFP表達(dá)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：通過精確到像素點(diǎn)的AO

12、TF控制，漂白細(xì)胞核（ROI），隨后漂白區(qū)域被來自細(xì)胞質(zhì)的EGFP緩慢恢復(fù)。第四節(jié) 細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化 56二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動(dòng)研究是在細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)觀測(cè)單一生物分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律的技術(shù)，它可以在納米空間尺度和毫秒時(shí)間尺度上精確測(cè)量單分子距離、位置、指向、分布、結(jié)構(gòu)以及各種動(dòng)態(tài)變化，具有直接，準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。單分子操作及力學(xué)性質(zhì)測(cè)量則是使用高精度、高靈敏度的操縱和檢測(cè)儀器直接或間接對(duì)單分子進(jìn)行力學(xué)操縱和測(cè)量的技術(shù)。目前常見的方法有光鑷、磁鑷和原子力顯微鏡等。針對(duì)不同的研究體系，可以在皮牛到微牛的作用力區(qū)間對(duì)單分子做到精確的力學(xué)控制和測(cè)量。57單分子技術(shù)58三、酵母雙雜交技術(shù) 酵母雙雜交

13、技術(shù)是一種利用單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高，快速，直接，可用于哺乳動(dòng)物的研究，也可用于研究高等植物蛋白質(zhì)之間的相互作用。但由于“獵物”蛋白與“誘餌”蛋白可能存在非特異性結(jié)合等原因，所以該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的問題。59酵母雙雜交技術(shù)60四熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)fluorescence resonance energy transfer, FRET 當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)

14、射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。 61五、放射自顯影技術(shù) 放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離射線對(duì)乳膠的感光作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性，定位與半定量研究的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。能夠?qū)?xì)胞或生物體內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究和追蹤，但其對(duì)樣品的制備和敷乳膠的要求比較嚴(yán)格，而且曝光時(shí)間一般長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。62放射自顯影技術(shù)原理：常用的放射性同位素：放射性同位素?fù)饺氲姆椒?根據(jù)標(biāo)記的時(shí)間分類：制樣過程：63第五節(jié) 模式生物與功能基因組的研究 一、細(xì)胞生物學(xué)研究常用的模式生物 （一）大腸桿菌（新增）：作為原核生物的代表已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究。它培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)快，基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，突變株的誘變、分離和鑒定

15、容易，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，進(jìn)行基因定位簡(jiǎn)單易行。其基因組序列已于1997年測(cè)定完畢，一條環(huán)狀DNA只有4.6X10kb，大約編碼4288個(gè)基因。早起關(guān)于基因表達(dá)調(diào)控的研究成果大多是以此為材料取得的。（二）酵母、（三）線蟲、（四）果蠅、（五）斑馬魚、（六）小鼠、（七）擬南芥6465二、突變體制備技術(shù)制備突變體的方法主要從DNA和RNA兩個(gè)層次上進(jìn)行，在RNA水平上主要是RNA干擾（RNAi），在DNA水平叫基因敲出，包括化學(xué)誘變法、P因子介導(dǎo)的突變和基于同源重組的定點(diǎn)突變。RNAi：化學(xué)誘變法：P因子介導(dǎo)的突變：基于同源重組的定點(diǎn)突變：66P因子67同源重組68三、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)是全面研究

16、細(xì)胞、組織乃至整個(gè)生命體內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。采用大規(guī)模、高通量、高速度的技術(shù)手段，通過全局性研究基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)在不同時(shí)間與空間的表達(dá)譜，全景式的揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)（雙向凝膠電泳、多維液相色譜、毛細(xì)管電色譜等）和蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等）。69（一）雙向凝膠電泳（2-DE） 是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，第一相是等電聚焦電泳，采用PH梯度，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。第二相是SDS，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離。2-分辨率高，但具有一定的局限性，強(qiáng)酸強(qiáng)堿蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量過大、過小的蛋白，疏水性蛋白以及低豐度蛋白難以分離，且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。70雙向電泳71（二）色譜技術(shù)利用各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間不同的分配系數(shù)，使其在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相間經(jīng)過反復(fù)多次分配，以不同速度移動(dòng)，從而獲得分離的方法。72（三）質(zhì)譜技術(shù)通過離子化裝置將分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來分離并確定相對(duì)分子質(zhì)量。根據(jù)蛋白質(zhì)分子離子化得方式不同可分為電噴霧離子化質(zhì)譜和基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜。質(zhì)譜技術(shù)能靈活的與多種蛋白分離技術(shù)聯(lián)合使用，且靈敏度高，準(zhǔn)確度高。73采用質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)的分子量74（四）蛋白質(zhì)芯片將蛋白質(zhì)結(jié)合到固相基質(zhì)上，然后與要檢測(cè)的組織或細(xì)胞“雜交”，從而對(duì)