GB4789.8小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)

1、GB/T4789-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 宣貫煙臺培訓(xùn)班課件主辦單位：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心食品伙伴網(wǎng)（煙臺富美特食品科技有限公司）合作單位：法國生物梅里埃中國有限公司 3M中國有限公司北京陸橋技術(shù)有限公司北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司GB/T 4789.82008小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)(Yersinia enterocolitica)耶爾森氏菌根據(jù)耶爾森氏菌在生物化學(xué)上的多樣性和DNA的相 關(guān)性，可以將這個群體的成員分為4種： 小腸結(jié)腸炎耶 爾森菌，中間耶爾森氏菌, 弗氏耶爾森菌和 克氏耶爾森 菌。后來耶爾森氏菌屬增加到11個種，其中有3種對人 類有潛在的致病性：鼠疫耶

2、爾森氏菌(Y.pestis)，小腸結(jié) 腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)和假結(jié)核耶爾森氏菌 (Y.pseudotuberculosis) 。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是最重要 的食源性致病菌。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分布很 廣，可存在于生的蔬菜乳和乳制品肉豆制品沙拉牡蠣蝦類同時，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌也存 在于環(huán)境中。河流湖泊土壤植被許多動物糞便中也能分離出該菌靈長類家畜山羊貓灰鼠狗水貂在港灣周圍，許多鳥類包括水禽 和海鷗可能是帶菌者。豬的帶菌率較 高,日本報(bào)告檢出 率為4%，加拿大 為3.6%，丹麥為 10-17%。在豬中, 該菌最易在扁桃腺 中發(fā)現(xiàn)。耶爾森氏菌作為一種食源性疾病，在世界范

3、 圍內(nèi)已爆發(fā)多起，食品和飲水受到污染，往往是 爆發(fā)胃腸炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地區(qū)暴發(fā)過兩起， 有138名兒童感染，源于攝入生牛奶。1976年在 美國紐約爆發(fā)過一起，有217名學(xué)生感染，在這 起發(fā)病過程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年發(fā)生于華盛頓的一起有87人 感染，污染源是用未經(jīng)氯處理的泉水做 的豆腐。由本菌引起的胃腸炎或中毒爆發(fā)，在歐 洲以冬春季節(jié)較多，夏季較少，而日本則以 夏季發(fā)病率較高。在我國福建省南部地區(qū)， 該菌是冬春季腹瀉的重要病原菌。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是30年代 引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病 原菌，為人畜共患病。潛伏期約攝食后 3-7天，也有報(bào)導(dǎo)11天才

4、發(fā)病。病程一 般為1-3天，但有些病例持續(xù)5-14天或 更長。主要臨床癥狀以發(fā)熱、腹痛腹瀉（水樣便或血便）為主，病 程3至4天，常呈自限性。發(fā)熱腹痛、腹瀉有的患者的主要癥狀為急性腹痛，這些 患者以青少年為主。急性期后一至3周出現(xiàn) 自身免疫性疾病，結(jié)節(jié)性紅斑，關(guān)節(jié)炎。急性腹痛關(guān)節(jié)炎少數(shù)患者可表現(xiàn)為腦膜炎，肺炎，敗 血癥即血液系統(tǒng)感染，盡管較少見，但死 亡率較高。本菌的易染人群為嬰幼兒，常引 起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。形態(tài)結(jié)構(gòu)（一）電鏡照片革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，大小為1-3.50.5-1.3m. 大多以單個散在的形式分布，偶爾成短鏈狀或堆狀形態(tài)結(jié)構(gòu)（二）小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌不形成芽胞， 無莢膜，

5、有周身鞭毛；但鞭毛只有在30 以下的條件培養(yǎng)時才可形成，溫度較高時 即喪失，因此在30以下有動力，而 35以上則無動力。培養(yǎng)特性兼性厭氧營養(yǎng)要求不高440均能生長，生長最適溫度20至28 。 但在4度也能生長，將此菌培養(yǎng)24 h后，可形 成扁平、半透明的小菌落。培養(yǎng)特性本菌生長溫度為30-37，但在22-29才 能使本菌的某些特性出現(xiàn)。4時能保存和 繁殖。本菌繁殖所需要的時間較長。在SS 或麥康凱瓊脂上于25經(jīng)24 h培養(yǎng)，菌落 細(xì)小，至48 h直徑才增大至0.5-3.0mm。菌 落圓整、光滑、濕潤、扁平或稍隆起，透 明或半透明；在麥康凱瓊脂上菌落淡黃色，如若微帶 紅色，則菌落中心的紅色常稍深

6、。本菌在肉 湯中生長呈均勻混濁，一般不形成菌膜。菌落扁平、無色或者淡紅色，直徑1-2 mm麥康凱平板上的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清學(xué)分型（1）小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株根據(jù)其耐熱性和耐受 高壓滅菌的菌體抗原能被血清學(xué)分型。Wanters將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和相關(guān)菌歸納 為54個血清群，Aleksii和Bockemuh等人提議將 小腸耶氏菌的血清群簡化為18個群。引起人類疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。我國以O(shè)3型為主，有毒菌株大多可以產(chǎn)生V和W 抗原， 產(chǎn)生耐熱腸毒素。某些菌株的O抗原與人的 組織具有共同的抗原，可以引起自身免疫性疾病 。傳播途徑日常生活中以糞口傳播為主該

7、菌侵入機(jī)體后主要在腸粘膜繁殖，引起 炎癥和潰瘍，病變可擴(kuò)展到腸系膜淋巴 結(jié)。致病性腸毒素 侵襲性 自凝性 VW抗原 毒性質(zhì)粒1、腸毒素該菌能產(chǎn)生耐熱性腸毒素，（分子量為10- 50KD），能耐熱12130分鐘，能在4保 存7個月，pH1-11中穩(wěn)定。但腸毒素的產(chǎn)生 僅限于22-25。血清型03、08和09幾乎經(jīng) 常產(chǎn)生腸毒素，在其他血清型中也有產(chǎn)生 腸毒素的菌株。該腸毒素被攝入即可引起 發(fā)病。2、侵襲性Hela細(xì)胞感染：血清型O1、O3、O4、O5B、 O8、O9、O15、O18、O20、O21和O22都能侵 入Hela細(xì)胞，鑒于Hela細(xì)胞感染陽性株多是人類 致病的常見血清型，以及從人和動物

8、死亡所見腸 類的侵入模型，表明Hela細(xì)胞侵入性在小腸結(jié)腸 炎耶爾森氏菌腹瀉的發(fā)病機(jī)理上是很重要的。Sereny試驗(yàn)：有人將11株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 的菌懸液接種于豚鼠眼結(jié)膜，有6株引起嚴(yán)重的角 膜結(jié)膜炎，即Sereny試驗(yàn)陽性。這6株均為O8血 清型。3、自凝性1980年Laird等人提出了一種測定本菌毒力 的簡易方法，即將試驗(yàn)菌接種于兩管含 10%小牛血清的組織培養(yǎng)液內(nèi)，分別置22和36+1培養(yǎng)，若22培養(yǎng)，菌液混 濁，而37培養(yǎng)，細(xì)菌凝結(jié)，上層液體透明，即為有毒力的菌株，稱為自凝陽性。 在檢查的180株菌中有25株陽性，這些陽性 菌株均能引起腹瀉。凝集試驗(yàn)在 培養(yǎng)液中于 22培 養(yǎng)，小

9、腸結(jié)腸炎耶爾 森氏菌呈現(xiàn)渾濁生長 (左邊試管)在 36培養(yǎng)時細(xì)菌自 身凝集，聚集在管底 。(右邊試管)4、VW抗原已知該菌的某些菌株具有與鼠疫耶爾森氏 菌和假結(jié)核耶爾森氏菌在免疫學(xué)上相同的 VW抗原。其在37生長時需要鈣而在25 生長時不需要鈣的菌株即含VW抗原。 Karmali等人將從病人糞便檢出的O21血清 型自凝陽性的菌株，在草酸鎂瓊脂上于 35培養(yǎng)不生長，用于口服小鼠則產(chǎn)生腹 瀉?？梢娮阅栃耘c缺鈣培養(yǎng)基上35無 生長能力是一致的，能使小鼠發(fā)生腹瀉。5、毒性質(zhì)粒耶氏菌病和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌帶有41- 48Mdalton的質(zhì)粒有關(guān)。這被認(rèn)為是毒性質(zhì) 粒，即與毒力有關(guān)的質(zhì)粒。有人將失去毒

10、 性質(zhì)粒的O8、O3和O9型菌株用小鼠作喂 飼試驗(yàn)，均不發(fā)病，但用帶毒性質(zhì)粒的O8 和O3型菌株試驗(yàn)時，小鼠則均發(fā)生腹瀉或 死亡。且菌株自凝試驗(yàn)的結(jié)果與毒性質(zhì)粒 的存在與否相一致。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在剛果紅腦 心浸液瓊脂上于35生長24h不帶質(zhì)粒的小腸結(jié)腸 炎耶爾森氏菌的菌落 為較大、不規(guī)則、扁 平、半透明攜帶質(zhì)粒的小腸結(jié)腸 炎耶爾森氏菌的菌落 為針尖大小、圓形、 凸起、紅色不透明GB/T 4789.8小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 的修訂背景主要參考資料主要修改情況及依據(jù)說明背景國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.8食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢 驗(yàn) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)是1984年我 國首次發(fā)布實(shí)施的，1994年和

11、2003年兩次 修訂發(fā)布。2005年國家疾病預(yù)防控制中心牽頭組織開 展食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的修訂工作，小 腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的測定方法被列入修 訂。主要參考資料（1）SN 017492出口食品小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)方 法FDABacteriological Analytical Manual , Yersinia enterocoliticaand Yersinia pseudotuberculosis（2001）ISO10273Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method f or the detection

12、 of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica(2003)UDC 579.842.23 Nordic committee on food analysis Yersinia enterocolitica.detection in foods呂志平 國內(nèi)外技術(shù)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物限量. 中國 標(biāo)準(zhǔn)出版社 北京 2002主要參考資料（2）Aleksic, S., and J. Bockemuhl. 1984. Proposed revision of the Wauters et al. antigenic scheme for seroty

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26、修改的內(nèi)容 修改依據(jù)及說明標(biāo)準(zhǔn)主要修改的內(nèi)容4冰箱冷增菌改為置26增菌48-72 h。生化鑒定增加了API 20E和Vitek GNI+。修改依據(jù)及說明增菌溫度及增菌時間的修改依據(jù)生化鑒定增加API 20E和Vitek GNI+的修 改依據(jù)增菌溫度及增菌時間的修改依據(jù)（1）原國標(biāo)使用的增菌時間為檢樣25 g（mL）225 mL改良磷酸鹽緩沖液，置4冰箱進(jìn) 行冷增菌7 d、 14 d、21 d.SN使用的的增菌時間為檢樣25 g（mL） 225 mL改良磷酸鹽緩沖液，于25培養(yǎng)482 h。FDA使用的增菌時間為無菌稱取25.0 g樣品 于225 mL蛋白胨山梨醇膽汁肉湯（PSBB）中，均質(zhì)30

27、s，置10培養(yǎng)10 d。ISO使用的的增菌時間為（1）樣品置于 PSB中，于2225振蕩培養(yǎng)4872 h或不振蕩培養(yǎng)5 d。（2）樣品置于ITC中 于25培養(yǎng)48 h。增菌溫度及增菌時間的修改依據(jù)（2）原國標(biāo)使用的增菌方法中的增菌溫度 低，增菌時間長。SN、FDA、ISO等組織 使用的增菌溫度均高于原國標(biāo)。增菌時間 也較短。通過我們的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用改良 磷酸鹽緩沖液增菌，于26增菌48 h72 h，可以達(dá)到原國標(biāo)方法的預(yù)期效果。生化鑒定增加API 20E和Vitek GNI的修改依據(jù)原國標(biāo)中未涉及， API 20E和Vitek GNI+方 法與比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國 家和組織的標(biāo)準(zhǔn)采

28、用，如SN、FDA、ISO 等組織。我國許多單位也積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，考慮 到此系統(tǒng)在國內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)狀，擬定在 生化鑒定方面“采納API 20E和Vitek GNI+為 傳統(tǒng)生化鑒定方法的選擇性替代方法”。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序樣品的采集和處理采集樣品后立即開始檢驗(yàn)，或者將 樣品于4保存，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)菌在4不能繁殖，但小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可 以生長。 雖然耶爾森氏菌也能夠從冷凍 食品中檢驗(yàn)出來，但建議檢驗(yàn)前不要冷 凍樣品。增菌以無菌操作取檢樣25 g（mL）放入裝有 225 mL改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無菌均質(zhì) 器內(nèi)，均質(zhì)12 min,置261增菌48 h72 h。堿處理將肉及其制品的增菌液0.5 mL與堿處理 液4.5 mL混合15 s。分離培養(yǎng)將增菌液和經(jīng)過堿處理的增菌液分別 接種CIN-I培養(yǎng)基和改良Y培養(yǎng)基,于 261培 養(yǎng)48 h，小腸結(jié)腸炎耶爾森 氏菌在CIN-I培養(yǎng)基上為紅色牛眼狀菌落, 在改良Y培養(yǎng)基上為無色透明、不粘稠的 菌落。CIN平板上的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌中心深紅色 ，周圍有清晰的無色透明帶，直徑1-2 mm改良克氏雙糖試驗(yàn)分別挑取上述可疑菌落35