分離分析中的新技術(shù)課件

1、第22章 分離分析中的新技術(shù)第一節(jié) 超臨界流體色譜法 （Supercritical Fluid Chromatography,SFC） 以超臨界流體作為流動相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質(zhì)，它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。 超臨界流體色譜技術(shù)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種嶄新的色譜技術(shù)。由于它具有氣相和液相所沒有的優(yōu)點，并能分離和分析氣相和液相色譜不能解決的一些對象，應(yīng)用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)Chester估計，至今約有全部分離的25涉及難以對付的物質(zhì)，通過超臨界流體色譜能取得較為滿意的結(jié)果。 1.超臨界流體的特性 (1) 物質(zhì)的臨界點 某些純物質(zhì)具有三

2、相點和臨界點。純物質(zhì)在三相點下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質(zhì)的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不會液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會變化。此時的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質(zhì)的沸點和三相點。 （2）超臨界流體的特性 超臨界流體具有對于分離極其有利的物理性質(zhì)。它們的這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。 超臨界流體的擴散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以獲得快速高效分離。 另一方面，其密度與液相色譜類似，便于在較

3、低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)。另外，超臨界流體的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如擴散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。 因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質(zhì)，從類似氣體到類似液體，無需通過氣液平衡曲線。超臨界流體色譜中的程序升密度相當于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度淋洗。 2.超臨界流體色譜儀 1985年出現(xiàn)第一臺商品型的超臨界流體色譜儀。很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點重要差別： （l）具有一根恒溫的色譜柱。這點類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對流動相的精確溫度控制。 （2）帶有一個限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對柱維持一個合適的壓力，并且通過它使

4、流體轉(zhuǎn)換為氣體后，進入檢測器進行測量。實際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。 3.壓力效應(yīng) 在SCF中，壓力的變化對容量因子k產(chǎn)生顯著影響，由于以超流體作為流動相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動相溶劑效率的提高，同時可縮短淋洗時間。 例如，采用CO2流體作流動相，當壓力由7.O106Pa增加到9.0106Pa時，對于十六碳烷烴的淋洗時間可由25min縮短到5min。在SFC中，通過程序升壓實現(xiàn)了流體的程序升密，達到改善分離的目的。程序升壓 4.固定相和流動相 用于SFC中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細管柱，目前，毛細管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人

5、們的青睞。 在SFC中，最廣泛使用的流動相是CO2流體，它無色、無味、無毒、易獲取并且價廉，對各類有機分子都是一種極好的溶劑。它在紫外區(qū)是透明的；臨界溫度31，臨界壓力7.29106Pa；在色譜分離中，CO2流體允許對溫度、壓力有寬的選擇范圍。有時可在流體中引入1%10%甲醇，以改進分離的選擇因子值。 除CO2流體外，可作流動相的還有乙烷、戊烷、氨、氧化亞氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氫呋喃等。 5. 檢測器 在高效液相色譜儀中經(jīng)常采用的檢測器，如紫外、熒光、火焰光度等都能在SFC儀中很好應(yīng)用。但SFC比起HPLC還具有一個主要優(yōu)點是可采用GC中火焰離子化檢測器（FID）。FID對一般有機物分

6、析具有較高的靈敏度，這也就提高了SFC對有機物測定的靈敏。 6超臨界流體色譜法與其他色譜法比較 （l）與高效液相色譜法比較 SFC法的柱效一般比HPLC法要高：當平均線速度為0.6cmS-1時，SFC法的柱效可為HPLC法的3倍左右，在最小板高下載氣線速度是4倍左右；由于流體的低粘度使其流動速度比HPLC法快，SFC法的分離時間比HPLC法短。 （2）與氣相色譜法比較 由于流體的擴散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬比GC要?。?SFC中流動相的作用類似LC中流動相，流體作流動相不僅載帶溶質(zhì)移動，而且與溶質(zhì)會產(chǎn)生相互作用力，參與選擇競爭。 如果把溶質(zhì)分子溶解在超臨界流體看作類似

7、于揮發(fā)，大分子物質(zhì)的分壓很大，可應(yīng)用比GC低得多的溫度，實現(xiàn)對大分子物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。 （3）應(yīng)用范圍的比較 SFC比起GC法測定相對分子質(zhì)量的范圍要大出好幾個數(shù)量級，基本與LC法相當。當然，尺寸排阻色譜法（SEC）所測分子質(zhì)量范圍是所有色譜法中最大的。 超臨界流體色譜法被廣泛應(yīng)用于天然物、藥物、表面活性劑、高聚物、多聚物、農(nóng)藥、炸藥和火箭推進劑等物質(zhì)的分離和分析。超臨界流體色譜的應(yīng)用 application of SFC1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m 63m i.d. 毛細管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO2 ；柱溫：120 C； 程序升壓；2.甘

8、油三酸酯的分析 四種組分僅雙鍵數(shù)目和位置不同，難分離； 色譜柱：DB-225 SFC毛細管柱； 流動相： CO2 ；從15MPa程序升壓到27MPa；2.5hr完全分離。 第二節(jié) 毛細管電泳 capillary electrophoresis 一、概述 早在一百多年以前，較原始的電泳實驗，是在一個U形一管中進行的，管中盛有溶液，兩端置有電極，加上幾百伏電壓后，首次實驗了對毒素和抗毒素的分離。1909年，L.Michaelis提出“電泳”這一術(shù)語，用于測定蛋白質(zhì)的等電點。1981年，Jorgenson 和 Lukacs 使用75m內(nèi)徑的熔融石英毛細管，電泳分離氨基酸和肽。至此，出現(xiàn)了毛細管電泳（

9、CE）技術(shù)。 毛細管電泳，又稱高效毛細管電泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE）： （1）在內(nèi)徑（1O200）m的石英毛細管中進行，在毛細管中的散熱較好，沿著管截面的溫度梯度很小，加在毛細管兩端的電壓可高達幾十千伏。 （2）不需要阻流介質(zhì)，但可使用凝膠作分子篩介質(zhì)。 （3）可使用在柱檢測法，縮短分析時間，結(jié)合計算機處理數(shù)據(jù)，可實現(xiàn)自動化操作。 （4）靈敏度高，檢測限可達（10-131O-15）mol，使用激光誘導(dǎo)的熒光檢測限可達（1O-191O-21）mol。 （5）分辨率高，理論塔板數(shù)為幾十萬至幾百萬米。 （6）取樣量少，有時只需

10、幾個納升（nL，10-9 L），流動相只需幾毫升。 二、高效毛細管由泳的基本原理 含離子的溶液在電場中，當有直流電通過溶液時，陰離子向陽極遷極，陽離子向陰極遷移，溶液的導(dǎo)電率取決于離于濃度和其遷移率(又稱淌度，即指溶質(zhì)在單位時間和單位電場強度下移動的距離)。 離子遷移率以表示，其大小受溶質(zhì)的電荷離子大小比例所控制。 在電場的影響下，帶電荷的質(zhì)點受到的力Fe等于其凈電荷q與電場強度E的乘積， Fe = qE。 電場強度E以每單位長度所加的電壓U來表示，即E=U/L，其中L是毛細管長度。Fe對正電荷為正值，對負電行為負值。電場力促使帶電質(zhì)點向兩極移動，質(zhì)點在移動過程中也受到一種與電場力方向相反的阻

11、滯力Fd，阻止其移動，此阻滯力與質(zhì)點的電泳速度成正比。 質(zhì)點平移動受到摩擦阻力，摩擦阻力正比于溶液的粘度、質(zhì)點大小和其電泳速度。由于存在摩擦阻力，一種帶電質(zhì)點在電場中運動，被加速到一有限速度，此速度取決于Fe和Fd，這一有限速度稱為電泳速度，ep 。 對于每一種質(zhì)點，在電場作用下的遷移均具有特定的速度。 HPCE分離，幾乎都是在熔融石英毛細管中完成的，熔融石英是一種高度交聯(lián)的SiO2聚合物，具有很好的抗拉強度。石英毛細管表面含有許多硅酸基：）SiOH，在一定的條件下可離解。使表面帶有負電荷。由于表面帶負電，因此，帶負電荷的離子被表面排斥，而帶正電均離子則被毛細管壁吸引。 在毛細管壁的陰離子，與

12、來自主體溶液中的陽離子在石英一溶液界面上形成雙電層。由于靜電場的作用，靠近表面的那些抗衡離子是不遷移的，因此構(gòu)成所謂稠密層。由于熱運動關(guān)系，離表面遠的離子構(gòu)成可遷移層或擴散層，因為在雙電層內(nèi)離子的立體分布，就形成一種電勢梯度. 當在毛細管兩端加有電場時；擴散層內(nèi)可遷移的陽離子向陰極移動。由于離子是被水化的，因此，在緩沖液中的液體也隨遷移著的陽離子一道，向陰極移動，形成一種液流，稱之為電滲流（electroosmotic flow，EOF），它是一種電泳驅(qū)動力。在雙電層內(nèi)，EOF總是向雙電層內(nèi)抗衡離子方向遷移，穿過雙電層的電勢下降的程度受電滲流速度所控制。電滲流的線速度eo ，可以定義為：式中，

13、eo是電滲遷移率，即在單位電場強度下，電滲流的線速度。 三、在CZE分離中的遷移時間、效率及分辨率 在電滲流存在下，離子的遷移速度可表示為： =（eo）U/Lt 式中，Ld是毛細管總長度；U是外加電壓。離子的遷移時間為t，則 t=LtLd/（eo）U 式中，Lt為進樣端到檢測器之間的毛細管長度，或稱為遷移長度。式中，D為溶質(zhì)的平均擴散系數(shù)。由上式可見，如果熱影響阿忽略不計的話，增大電壓，可增加分離效率。 按Gidding方程，分辨率R只可定義為式中，是兩溶質(zhì)的區(qū)帶間的相對速度差。分離效率n可表示為1和2兩溶質(zhì)的電泳遷移率，而是它們的平均電泳遷移率。 在許多情況下，電滲流速度比許多質(zhì)點的電泳速度要快，因此，在毛細管中的所有溶質(zhì)將朝一個方向遷移，不管它們帶