分析化學(xué)第9章吸光光度法

1、分析化學(xué)第9章 吸光光度法Spectrophoto metry返回基本內(nèi)容和重點要求掌握物質(zhì)對光的選擇性吸收、吸光度和透光度、朗伯比耳定律及摩爾吸光系數(shù)等知識；了解比色分析和分光光度法的特點、基本原理、儀器構(gòu)造和各部件的作用；學(xué)習(xí)顯色反應(yīng)和顯色條件的選擇；理解分光光度法定量分析中各種影響因素；了解紫外吸收光譜法的特點及應(yīng)用。返回第9章 吸光光度法9.1 吸光光度法基本原理9.2 目視比色法及光度計的基本部件9.3 顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇9.4 吸光度測量條件的選擇9.5 吸光光度法的應(yīng)用9.6 紫外吸收光譜法簡介9.7 分子發(fā)光分析法簡介返回9.1 吸光光度法基本原理一、方法依據(jù)及分類二、方

2、法特點三、光的基本性質(zhì)四、物質(zhì)對光的選擇性吸收五、光的吸收基本定律朗伯比耳定律六、偏離比耳定律的原因返回一、方法依據(jù)及分類吸光（或分光）光度法：基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色法、可見及紫外光度法及紅外光譜法等。比色分析法通過目視比較顏色的深淺來測定物質(zhì)的濃度。吸光光度法使用光度計測定的方法。返回二、方法特點靈敏度高、選擇性好準確度較高分析快速、儀器簡單、操作簡便應(yīng)用廣泛返回三、光的基本性質(zhì)光的波動性和微粒性電磁波譜圖單色光與復(fù)合光互補色光返回1. 光的波動性和微粒性返回2. 電磁波譜圖波長/nm10-1 1 10 102 400 760 103 104 105 106

3、107 108光譜名稱X射線紫外光可見光紅外光微波躍遷類型內(nèi)層電子中層、外層電子外層電子分子振動或轉(zhuǎn)動分子轉(zhuǎn)動分析方法X射線光譜法紫外光度法比色及可見光度法紅外光譜法微波光譜法UltravioletVisible Spectrophotometry返回3. 單色光與復(fù)合光單色光：具有同一波長的光復(fù)合光：不同波長組成的光可見光的波長大約在400760nm之間，由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種色光按一定比例混合而成，各種色光具有一定的波長范圍。返回4. 互補色光如果把適當顏色的兩種色光按一定強度比例混合，可以組成白光，這兩種色光稱為互補色光。返回四、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)顏色和吸收顏色的關(guān)系雙

4、原子分子能級示意圖吸收光譜圖分析依據(jù)返回1. 物質(zhì)顏色和吸收顏色的關(guān)系白光KMnO4紫色返回表9-1 物質(zhì)顏色和吸收顏色的關(guān)系物質(zhì)顏色吸收光顏色波長范圍/nm黃綠紫400450黃藍450480橙綠藍480490紅藍綠490500紫紅綠500560紫黃綠560580藍黃580600綠藍橙600650藍綠紅650750返回152. 雙原子分子能級示意圖AV43210V43210BJ420返回16返回3. 吸收光譜圖400 450 500 550 600 650 /nmA0.80.60.40.2最大吸收波長max返回4. 分析依據(jù)定性分析：最大吸收波長max定量分析：吸光度大小400 450 500

5、 550 600 650 /nmA0.80.40.60.212返回五、光的吸收基本定律朗伯比耳定律透光度（率）與吸光度朗伯比耳定律吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)吸光度的加合性返回1. 透光度（率）T與吸光度AI0IrIaIt透光率或透射比吸光度Transmittance and Absorptivity返回 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T% 1.0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 0 A透光度 T與吸光度A的關(guān)系返回2. 朗伯比耳定律Lambert-Beers LawA吸光度K比例常數(shù)，與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溫度等有關(guān)b液

6、層厚度，cmc溶液的濃度，molL-1或g L-1返回3. 吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)吸光系數(shù)a：摩爾吸光系數(shù)（或）：關(guān)系： M acgL-1bcma=A/( b c)， Lg-1cm-1c mol L1bcm =A/(b c)，Lmol-1cm-1返回例 150mL比色管中，加入含有的Fe2+溶液，加入鄰二氮菲顯色劑，用水稀釋至50mL，用2cm比色池，在分光光度計上測得吸光度，計算摩爾吸光系數(shù)？解：返回4. 吸光度的加合性多組分體系中返回六、偏離比耳定律的原因標準曲線（校正曲線）非單色光引起的偏離化學(xué)因素引起的偏離介質(zhì)不均勻引起的偏離返回Standard curve，calibrated cu

7、rve，working curve（一）. 標準曲線（校正曲線） A0.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10mg/mL返回A0.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10mg/mL正偏離負偏離返回（二）偏離原因1. 非單色光引起的偏離目前各種分光光度計得到的入射光實際上都是具有某一較窄波段的復(fù)合光，物質(zhì)對不同波長光的吸收程度的不同，因而導(dǎo)致對朗伯比耳定律的偏離?？朔菃紊庖鸬钠x的措施：使用比較好的單色器；人射光波長選擇在被測物質(zhì)的最大吸收處；測定時應(yīng)選擇適當?shù)臐舛确秶７祷?. 化學(xué)因素引起的偏離稀溶液能很好服從比

8、耳定律。溶液中吸光物質(zhì)常因解離、絡(luò)合、締合或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而形成新化合物或改變其濃度，因而導(dǎo)致偏離朗伯比耳定律。在分析測定中，要控制溶液的條件，使被測組分以一種形式存在，以克服化學(xué)因素所引起的對朗伯比耳定律的偏離。返回9.2 目視比色法及光度計的基本部件一、目視比色法二、光度計的基本部件三、方法比較返回一、目視比色法（ Colorimetry ）方法依據(jù)用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以確定物質(zhì)含量的方法。12481632x返回優(yōu)點儀器簡單（或不需要）、操作簡便，適宜于大批試樣的分析。靈敏度高，因為是在復(fù)合光白光下進行測定，故某些顯色反應(yīng)不符合朗伯比耳定律時，仍可用該法進行測定。缺點準確度不高

9、，標準系列不能久存，需要在測定時臨時配制。返回二、光度計的基本部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)返回1. 光源在可見光區(qū)，常用鎢燈或碘鎢燈作光源，它們輻射3202500nm波長的光；在近紫外區(qū)，常使用氫燈或氘燈，它們能輻射180375nm波長的光。 具有足夠的光強度，并能穩(wěn)定。光源單色器檢測系統(tǒng)吸收池返回2. 單色器濾光片由有色玻璃片制成，只允許和它顏色相同的光通過，得到的是近似的單色光。棱鏡用光學(xué)玻璃或石英制成，光通過棱鏡發(fā)生折射而色散。光柵光通過光柵發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。光源單色器檢測系統(tǒng)吸收池返回3. 吸收池也稱比色皿，用于盛吸收溶液；由無色透明的光學(xué)玻璃或石英制成；液層厚度為、1、2、3

10、cm等的一套長方形比色皿。光源單色器檢測系統(tǒng)吸收池返回4. 檢測系統(tǒng)硒光電池或光電管或光電二極管陣列作檢測器，檢流計或毫伏表作讀數(shù)裝置。另可配置記錄儀、數(shù)字顯示器及計算機等。光源單色器檢測系統(tǒng)吸收池返回 紫外-可見分光光度計雙光束紫外可見分光光度計9.3 顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇一、顯色反應(yīng)二、顯色反應(yīng)的選擇三、顯色條件的選擇四、顯色劑返回一、顯色反應(yīng)（ Color reaction ）待測物質(zhì)本身有較深的顏色，直接測定。待測物質(zhì)是無色或很淺的顏色，需要選適當?shù)脑噭┡c被測離子反應(yīng)生成有色化合物再進行測定，此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑（color reagent）。顯色反應(yīng)的類型：主

11、要有氧化還原反應(yīng)和絡(luò)合反應(yīng)（最常用）兩大類。返回二、顯色反應(yīng)的選擇靈敏度高，有色物質(zhì)的應(yīng)大于104；選擇性好，干擾少，或干擾容易消除；有色化合物的組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定(至少保證在測量過程中溶液的吸光度基本恒定)；顯色劑在測定波長處無明顯吸收，即顯色劑對光的吸收與絡(luò)合物的吸收有明顯區(qū)別，要求兩者的吸收峰波長之差（稱為對比度）大于60 nm。 返回三、顯色條件的選擇顯色劑用量酸度顯色溫度顯色時間干擾的消除溶劑返回1. 顯色劑的用量M + R = MR（被測組分） （顯色劑） （有色絡(luò)合物）為使顯色反應(yīng)進行完全，需加入過量的顯色劑。但有些顯色反應(yīng)，顯色劑加入太多，反而會引起副反應(yīng)，對測定不利。在實

12、際工作中根據(jù)實驗結(jié)果來確定顯色劑的用量。返回cA0cA0cA0123返回2. 酸度M+HR=MR + H+影響顯色劑的平衡濃度和顏色影響被測金屬離子的存在狀態(tài)影響絡(luò)合物的組成 制作pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。 pHA0返回3. 顯色溫度顯色反應(yīng)大多在室溫下進行；有些顯色反應(yīng)需加熱至一定溫度完成；有些有色物質(zhì)溫度偏高時易分解。制作溫度與吸光度關(guān)系曲線確定顯色溫度范圍。返回4. 顯色時間有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)保持不變；有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開始褪色；有些顯色反應(yīng)進行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時間后才穩(wěn)定；制作吸光度-時間曲線確定適

13、宜時間。返回5. 干擾的消除干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)，在測量條件下也有吸收，造成正干擾；干擾物質(zhì)與被測組分反應(yīng)或與顯色劑反應(yīng)，使顯色反應(yīng)不完全，也會造成干擾；干擾物質(zhì)在測量條件下從溶液中析出，使溶液變混濁，無法準確測定溶液的吸光度。返回干擾的消除加入絡(luò)合掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑，使干擾離子形成無色絡(luò)合物或無色離子；選擇適當?shù)娘@色條件以避免干擾；選擇適當?shù)墓舛葴y量條件；分離干擾離子。 返回6. 溶劑有機溶劑降低有色化合物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深；還可能提高顯色反應(yīng)的速率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。返回四、顯色劑無機顯色劑有機顯色劑多

14、元絡(luò)合物返回1. 無機顯色劑無機顯色劑不多，因為生成的絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高，目前應(yīng)用不多。如用KSCN顯色測鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測硅、磷和釩等。返回2. 有機顯色劑有機顯色劑分子中含有生色團和助色團。生色團（chromophoric group）：含不飽和鍵的基團，如偶氮基、對醌基和羰基等。這些基團中的電子被激發(fā)時需能量較小，可吸收波長400nm以上的可見光而顯色。助色團（auxochromic group）：含孤對電子的基團，如氨基、羥基和鹵代基等。助色團與生色團的不飽和鍵作用，使顏色加深。 返回常用有機顯色劑常用2類：偶氮類，如：偶氮胂(鈾試劑)強酸性溶液中測Th()

15、、Zr()、U()等；在弱酸性溶液中測稀土金屬離子。三苯甲烷類，如：鉻天青S：測定Al3+等許多金屬離子； 由如：結(jié)晶紫：測定Tl3+。 返回3. 多元絡(luò)合物三元絡(luò)合物離子締合物金屬離子絡(luò)合劑表面活性劑體系雜多酸返回多元絡(luò)合物由三種或三種以上的組分所形成的絡(luò)合物。目前應(yīng)用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的三元絡(luò)合物。三元絡(luò)合物在吸光光度分析中應(yīng)用較普遍。返回三元配合物特性（1）比較穩(wěn)定，可提高分析測定的準確度和重現(xiàn)性。 如：Ti-EDTA-H2O2穩(wěn)定性比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的穩(wěn)定性分別增強1000倍和100倍。返回（2）具有更高的靈敏度和更大的對比度。 如： V(

16、V)、H2O2 的二元配合物，測釩靈敏度低，而V(V)，H2O2和吡啶偶氮間苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色絡(luò)合物，用于釩的測定，其靈敏度高，最大吸收波長紅移。 返回（3）具有更高的選擇性。 如： 鈮和鉭都可以與鄰苯三酚生成二元配合物，但在草酸中，只有鉭-鄰苯三酚-草酸的黃色三元配合物形成。返回（4）可以改善顯色條件。 如：有CTMAC（氯化十六烷基三甲基胺）存在時,Al3+與絡(luò)天青S形成三元絡(luò)合物比沒有CTMAC時形成二元絡(luò)合物的pH范圍寬。等.。返回9.4 吸光度測量條件的選擇一、入射光波長的選擇二、參比溶液的選擇三、吸光度讀數(shù)范圍的選擇返回一、入射光波長的選擇“最大吸收原則”（max

17、imum absorption）不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對朗伯-比耳定律的偏離。“吸收最大、干擾最小” 在最大吸收波長處有其他吸光物質(zhì)干擾測定時選擇。返回A/nm012A/nm012返回二、參比溶液的選擇參比溶液的作用：調(diào)節(jié)儀器零點，消除由吸收池壁及溶劑、試劑等對入射光的反射和吸收造成透射光強度的減弱，使光強度的減弱僅與溶液中待測物質(zhì)的濃度有關(guān)。使用參比溶液校正： A=(I0/I) (I參比/I試液) 返回選擇參比溶液的原則：純?nèi)軇┳鲄⒈纫海簝H待測物與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收。不加試樣溶液的試劑空白作參比液：顯色劑或其它試劑略有吸收。不加顯色劑的被測試液作參比液：顯色劑為無吸

18、收，被測試液中存在其他有色離子；若同時顯色劑略有吸收，可在試液中加適當掩蔽劑掩蔽被測組分后再加顯色劑作參比液。返回當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。待測溶液的透射比T在15%65%之間，或使吸光度A在之間，才能保證測量的相對誤差較小。0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 T108642108642|Et|%0.368返回上一頁下一頁退出三、吸光度讀數(shù)范圍的選擇為使測量結(jié)果得到較高的準確度，一般應(yīng)控制標準溶液和被測試液的吸光度在適宜范圍內(nèi)?？赏ㄟ^控制溶液的濃度（如改變試樣的取樣量或改變顯色體系的體積）或選擇不同厚度的吸收池來達到目的。 返回 1.2810-4

19、-1KMnO4溶液在波長525nm處用1cm吸收池測得透光度為，試問（）計算KMnO4溶液的摩爾吸光系數(shù)為多少？（）在相對誤差最小時的吸光度測定，則KMnO4溶液的濃度為多少？例題（）A=（1/T）A=bc， =A/ bc=0.3011（1.2810-4） =2.35103 （-1cm-1） （）在相對誤差最小時測定，其C=A/b=0.4341（2.35103） = 1.8510-4-19.5 吸光光度法的應(yīng)用一、單組分分析1吸光系數(shù)法 2對照法3標準曲線法續(xù)前標準曲線法示例 蘆丁含量測定0.710mg/25mL續(xù)前二、多組分分析三種情況（如兩組分）： 1吸收光譜不重疊（互不干擾）在各自max

20、下不重疊分別按單組分分析續(xù)前2吸收光譜部分重疊 1測A1b組分不干擾可按單組分定量測Ca；2測A2a組分干擾不能按單組分定量測Ca 續(xù)前3吸收光譜完全重疊混合樣品測定 解線性方程組法步驟：三、酸堿離解常數(shù)的測定（對光有吸收） AHL和AL-分別為有機弱酸HL在強酸和強堿性時的吸光度，它們此時分別全部以HL或L-形式存在。因此HL H+ + L-即 A= HL + L H+cKa+H+ AHL= HLc AL= LcpKa=pH+ lg A - AL-AHL- Alg A - AL-AHL- A對pH作圖即可求得pKa A=HLHL+ LL-Ka+H+ Kac 四、配合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定 摩

21、爾比法 制備一系列含釕3.010-5 mol/L (固定不變)和不同濃度（小于12.010-5 mol/L）的PDT溶液，按實驗條件，485nm測定吸光度,作圖。PDT:Ru=2:1M + nL MLn穩(wěn)定常數(shù)的測定自學(xué)。 五、雙波長分光光度法 原理： A = Al1-Al2 = （l1- l2）b c 波長對的選擇： 如 等吸光度點法應(yīng)用：多組分混合物的測定；渾濁樣品的測定（消除背景吸收的干擾）；研究反應(yīng)動力學(xué)。 選l1為參比波長, l2為測量波長得 Al1= xl1bcx + yl1bcy Al2= xl2bcx+ yl2bcy A=Al2-Al1= ( x2bcx+ yl2bcy)-(

22、xl1bcx+ yl1bcy)在等吸光度的位置(G, F), yl2 yl1，則上式成為 A=( xl2- xl1）bcx A與cx成正比, 可用于測定例,苯酚(x)與2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的雙波長分光光度法測定。 9-6 紫外吸收光譜法簡介 (Ultraviolet Spectrophotometry, UV ) 紫外吸收光譜法的基礎(chǔ)是物質(zhì)對紫外線選擇性吸收，與可見分光光度法一樣，也是基于分子中價電子在能級之間的躍遷所產(chǎn)生的吸收。 相同：產(chǎn)生機理（基于分子中價電子能級躍遷）；定量分析的原理相同（朗伯-比爾定律）；儀器組成部件相同。 差異：儀器上 光源（氘燈）、光學(xué)材料（

23、石英）、檢測器（對紫外光響應(yīng)靈敏）。 應(yīng)用上，紫外光譜在有機物結(jié)構(gòu)分析上有較好的應(yīng)用。 紫外吸收光譜法與可見分光光度法對比COHnpsH 按分子軌道理論，在有機物分子中有幾種不同性質(zhì)的價電子： 電子、電子、n電子，當分子吸收一定的能量后，這些價電子將躍遷到較高的能級（激發(fā)態(tài)），這種特定的躍遷反映了分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。一、有機化合物電子躍遷的類型 分子軌道理論認為其躍遷為：【基態(tài)】成鍵軌道（非鍵軌道）【激發(fā)態(tài)】反鍵軌道。 主要有4種躍遷，所需能量大小順序為： n n sp *s *npE 當外層價電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷。 1. * 躍遷： 飽和烴（甲烷，乙烷） 能量很高，

24、150nm（真空紫外區(qū)） 2. n * 躍遷： 含雜原子飽和基團（OH，NH2） 能量較大，150250nm（真空紫外區(qū)）3.*躍遷： 不飽和基團（CC，C O ） 能量較小，200nm （近紫外區(qū)） 體系共軛，E更小，更大4.n*躍遷： 含雜原子不飽和基團 （C N ，C O ） 能量最小， 200400nm（近紫外區(qū)）二、紫外吸收光譜的重要吸收帶 R吸收帶：由n*躍遷產(chǎn)生的吸收帶稱為R帶(德文Radikal)；分子中同時存在雜原子和雙鍵可產(chǎn)生n* 躍遷。比如 CO，NN，NO，C=S。 R帶的特征：能量最小，270700 nm； max 104（位于遠紫外，200nm），而E2帶max10

25、3（位于近紫外端，200nm）。如：苯的E帶。 B吸收帶的特征：以苯為例，位于230270 nm；寬峰，禁阻躍遷，弱吸收帶（max200）。包含多重峰或稱精細結(jié)構(gòu)。極性溶劑的影響 極性溶劑使精細結(jié)構(gòu)消失三、影響紫外吸收光譜的因素 物質(zhì)的紫外吸收光譜受溶劑性質(zhì)、溶液pH、空間效應(yīng)等許多因素的影響。 溶劑的影響:改變光譜形狀（如前例）；使吸收波長改變。比如，極性大溶劑使*紅移，使n* 藍移。 pH的影響：如苯胺在乙醇中max=230nm，而在稀酸中max=203nm，與苯的E2相似?？捎脕龛b別堿性基團（胺基）的存在。 空間效應(yīng)的影響：空間阻礙會影響到較大共軛體系的生成，使max較短，小。 1、定量

26、分析 紫外吸光光度法的定量測定原理及步驟與可見區(qū)吸光光度法相同。 其應(yīng)用很廣泛，僅以藥物分析來說，利用紫外吸收光譜進行定量分析的例子很多，例如一些國家已將數(shù)百種藥物的紫外吸收光譜的最大吸收波長和吸收系數(shù)載入藥典。 紫外吸光光度法可方便地用于直接測定混合物中某些組分的含量，如魚肝油中的維生素A等。四、紫外吸收光譜法的應(yīng)用 用經(jīng)驗規(guī)則（如Woodward規(guī)則等）計算max，與實測值比較判斷。 比較吸收光譜的一致性。 在相同的條件下，比較未知物與已知標準物的紫外光譜圖。 若譜圖一致，表明它們含有相同的生色團，但不一定是同一化合物。進一步可比較吸收系數(shù)。2、有機物定性分析對比吸收光譜的一致性 三種甾體

27、激素的紫外吸收光譜(10g/ml甲醇溶液）醋酸潑尼松醋酸氫化可的松醋酸可的松對比吸收系數(shù)：安宮黃體酮(M=386.53)炔諾酮(M=298.43)max=2401nmmax=2401nm3344如果待測物和標準物的吸收波長相同、吸收系數(shù)也相同，則可認為兩者是同一物質(zhì)。3、同分異構(gòu)體和順反異構(gòu)的確定maxEtOHmax 10500 29000 順式： 短， 小 反式： 長， 大位阻效應(yīng)互變異構(gòu)現(xiàn)象 max 247nm 310nm共軛 4、純度檢查 如果一化合物在紫外區(qū)沒有吸收峰，而其中的雜質(zhì)有較強的吸收峰，可方便地檢出該化合物中的痕量雜質(zhì)。 如果一化合物，在可見區(qū)或紫外區(qū)有較強的吸收帶，有時可用摩爾吸收系數(shù)來檢