基于PCR的染色體步查技術(shù)文本課件

1、基于PCR的染色體步查技術(shù)措勢(shì)奴晃棵睡藕鄲眨淡擰籬膀瞇簿晰麻似瞥鉚比干燴浙暇試糠姜眶苦呻哩基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)染色體步查(Chromosome walking) 是指由生物基因組或基因組文庫(kù)中的已知序列出發(fā),逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目的序列的核苷酸組成的方法和過(guò)程。 經(jīng)典的染色體步查方法比較煩瑣，適合于長(zhǎng)距離步行，而基于PCR的染色體步行技術(shù)相對(duì)而言則比較簡(jiǎn)便，適合于短距離步行。孺碎晴苗擰超曉鎂蚤替蝕貧雷班蓄母撰性氨丹絮芭刀寂咖務(wù)翅榔匪峻皖浙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù) 典型的PCR反應(yīng)需

2、要2個(gè)分別位于目的序列兩端的引物，而在染色體步行時(shí)目的序列只有一端是已知的，因此利用PCR技術(shù)進(jìn)行染色體步行的關(guān)鍵在于提供PCR需要的另一個(gè)引物。利用載體或接頭的PCR技術(shù)利用引物錯(cuò)配的染色體步查技術(shù)利用隨機(jī)引物的染色體步查技術(shù)(TAIL-PCR) 絳傣逼穎籽洗畜購(gòu)虎深歹撒鷗預(yù)振蒜備冷列項(xiàng)幼咳精汗萬(wàn)邀灌翼源倦釀弓基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體或接頭的PCR技術(shù) 這類方法的第一步通常都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭,以提供PCR需要的另一端引物.利用載體的PCR利用接頭的PCR寡聚盒介導(dǎo)的PCR環(huán)狀PCR I-PCR(Inverse PCR) P-PCR(Pan

3、handle PCR) 娘掂耳繪舌砧繁吵很繪草督巳局協(xié)箭紙泳恥桿微蓋蕪浮警酞懦蜀暑晝清匝基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體的PCR 1989年，Shyamala等利用單特異引物PCR(single specific primer PCR, SSPPCR)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子為起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)步查。用PstI+ AraIM酶切基因組DNA，PstI+XmaI酶切載體DNA,然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增. 由于非特異片段沒(méi)有特異引物的結(jié)合位點(diǎn),即使有載體連接到非特異片段，它也不能得到大量擴(kuò)增，而使特異片段

4、得到有效擴(kuò)增。 在這種方法中，如果用合適的接頭代替載體效果也會(huì)一樣。這種方法原理簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，但操作較為繁瑣，特異性較低，即使用嵌套引物擴(kuò)增也往往會(huì)造成非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物仍需雜交進(jìn)一步確定。之后出現(xiàn)了一些方法利用不同的技術(shù)增強(qiáng)PCR的特異性。菌恤婚齒李證靈皮該高來(lái)凌剩屎釋謠斥膘揖藤波雖冠吏葫諾毆瘡磨購(gòu)達(dá)左基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用接頭的PCR 1995年，Siebert結(jié)合Vectorette PCR和Suppression PCR設(shè)計(jì)改進(jìn)了利用接頭的PCR 。主真頑鄂壽瓤匿鈕辱揍州娘囚豁成枚撮謂樞兌污氣贖伸謀柿迅捉廓娥侶蟹基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PC

5、R的染色體步查技術(shù)(1)選擇合適的酶切位點(diǎn)酶切總基因組；(2)用連接反應(yīng)將人工合成的接頭連接在酶切片斷兩端；(3)S-PCR(suppression PCR) 所連接的雙鏈接頭是反向重復(fù)序列。A,如果PCR產(chǎn)物的兩末端是雙鏈接頭序列，由于反向末端重復(fù)序列的存在，每條DNA鏈的末端就要形成panhandle結(jié)構(gòu)，故而阻止PCR的指數(shù)增加。B,如果PCR產(chǎn)物一端是特異引物序列，另一端是接頭序列時(shí)形不成panhandle結(jié)構(gòu)，PCR擴(kuò)增正常進(jìn)行。耀墩卵殃鬼沼牟攀宗戶卞諒蕾蟹疊跡竟乒蔗隙堡蛻途煎述像漂船暑厄藤啥基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)(4)vectorette接頭由一條長(zhǎng)鏈

6、和一條短鏈組成;短鏈3端用-NH2封閉,使接頭中的短鏈不會(huì)在PCR開(kāi)始時(shí)自身延長(zhǎng);在第一個(gè)延伸反應(yīng)中,接頭引物無(wú)模板配對(duì),只有特異引物起作用延伸出一條單鏈;在第二個(gè)延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個(gè)反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開(kāi)始擴(kuò)增.NH2NH2閩犯然慕咬餅注權(quán)花欠誹貿(mào)妒謙坯納老疹單茨老拔船遞輔欺捌堡籠巢似硒基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Gel electrophoresis analysis of the representative PCR products derived from L. borgpetersenii genomic DNA. The PCR walki

7、ng templates were prepared from EcoRV-digested DNA or from PvuII digested L. borgpetersenii genomic DNA.Lane 1, DNA marker; lane 2, primary PCR products from primers AP1 and P12; lane 3, secondary PCR products from primers AP2 and P13. The arrow indicates the PCR fragment that was cloned for sequenc

8、ing.刨竅疇嶄撞雁漫常賤運(yùn)錦饋賣堪主恕抬招泡魄悼深評(píng)鞘纓渝鎂禽紛背貍滬基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)2000年，Mogens Kilstrup 進(jìn)一步改進(jìn)此方法.不要求接頭的兩條寡核苷酸鏈一長(zhǎng)一短，而使接頭兩端均為-OH,不含磷酸基團(tuán)。在第一個(gè)變性反應(yīng)時(shí)，和接頭引物配對(duì)的接頭寡核苷酸鏈會(huì)游離出來(lái)；在第二個(gè)延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個(gè)反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開(kāi)始擴(kuò)增.念茁滄眠老饑賀鐮機(jī)呼丙鈉沒(méi)見(jiàn)攘傲弊兼敬烤頻浸子摳吊蘊(yùn)鈉壩甲娛閡播基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)A,B,C EcoRI酶切基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物D,E,F HindIII酶切基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物

9、A,D 只加接頭引物B,C,E,F 不同的特異引物和接頭引物命縱衡烯棄堿梢麗愉秀獵衍臍靈假菠痘模卿剿錯(cuò)又吵躁服釉搪腮盜次骸宵基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)寡聚盒介導(dǎo)的PCR 寡聚盒介導(dǎo)PCR是利用雙鏈接頭進(jìn)行染色體步行的方法，為了增加反應(yīng)的特異性他們?cè)谝粋€(gè)特異引物上增加了便于選擇特異產(chǎn)物的生物素標(biāo)記。 寡聚盒介導(dǎo)PCR在第一次PCR反應(yīng)中用帶有生物素標(biāo)記的特異引物進(jìn)行單引物PCR，合成含有目的序列和接頭序列的單鏈DNA產(chǎn)物，而后用鏈霉親和素覆蓋的磁珠在反應(yīng)混合物中捕捉分離帶有生物素標(biāo)記的單鏈產(chǎn)物，以回收的單鏈產(chǎn)物為模板用無(wú)標(biāo)記的嵌套特異引物和接頭引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，

10、終產(chǎn)物純化后直接進(jìn)行測(cè)序。由于在特異引物上增加了有利于選擇特異產(chǎn)物的生物素標(biāo)記，這種技術(shù)的特異性比較高。茨哥值盔韌摯池縫刮禍葦狂鮮誘木睬芯瀉契鴨鄉(xiāng)吐晦割粵三饞命琢盅筋闌基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)環(huán)狀PCR 環(huán)狀PCR是能夠根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)兩對(duì)嵌套PCR引物進(jìn)行染色體步行的方法。包括I-PCR(Inverse PCR) P-PCR(Panhandle PCR) I-PCR與P-PCR的不同之處在于前者用DNA連接酶使酶切片段自連產(chǎn)生環(huán)狀模板，而后者則利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板。澇年霄沽傘礎(chǔ)浚騙輔砂抬僅揚(yáng)淮湛蛀教甄凳薄垂濺賢曲蓄幾販屏崗爭(zhēng)趣讕基

11、于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)I-PCR (Inverse PCR) :基因組DNA經(jīng)酶切后自連成環(huán)狀分子;再用另外一種限制性內(nèi)切酶在已知序列處切開(kāi)，又成線狀DNA;根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。I-PCR被用于從酵母基因組DNA中分離YAC克隆末端，也被成功的應(yīng)用于從植物基因組DNA中分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼的特異區(qū)域。主要缺點(diǎn):需控制酶切片段長(zhǎng)度,長(zhǎng)度太長(zhǎng)會(huì)使擴(kuò)增效率下降;環(huán)化反應(yīng)難以控制，有線狀串聯(lián)體成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增.碑束躊伴避菜圖綽估楷變溪淤叛末咖窯拜修搖幸剛帆撒淖碳苫瘓局畢何葫基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)P-PCR (

12、Panhandle PCR） 與IPCR相比，PPCR是利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板。糊柔禾曝屢幌牡躁蹤鎊咯林武歡讓屠夯疾鎳嗓矮懈祖挾使能鋁虐皮趙房知基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)墅茍?jiān)搴プx槐屈原鍬要遇銅賞磚硯典牽拋棍資賞鹿優(yōu)曼搔挖乖忱藐挫摻基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)嵌套PCR(Nested PCR)黨嫡圃攬贓九縷巒狗阿陵找樓盞呈脅犁礁純婿啪訂柜翅櫻膨悉諒痕騁卻固基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用引物錯(cuò)配的染色體步查技術(shù) 在PCR過(guò)程中總有或多或少的產(chǎn)物是由錯(cuò)配的引物延伸而生成的，這本來(lái)是影響PC

13、R反應(yīng)特異性的不利因素但是PCR是一種相當(dāng)靈活的技術(shù)，Screaton等和Parker等報(bào)道的染色體步查技術(shù)就是根據(jù)PCR的這一性質(zhì)而設(shè)計(jì)的。馴走渤訣廓鉚銳毀止濺贈(zèng)爛鍵靶辜祭測(cè)恭優(yōu)揉授籮憑團(tuán)較屏冶砌污咯佛爽基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Screaton等發(fā)現(xiàn)只用一個(gè)引物的PCR反應(yīng)也能生成少量雙鏈DNA產(chǎn)物，這是由于在不嚴(yán)格的反應(yīng)條件下引物發(fā)生錯(cuò)配引起的。引物的錯(cuò)配可以產(chǎn)生多種長(zhǎng)度不同的產(chǎn)物:真實(shí)結(jié)合位點(diǎn)與另一端錯(cuò)配位點(diǎn)之間的擴(kuò)增兩個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)之間的擴(kuò)增(錯(cuò)配的結(jié)果將可以產(chǎn)生一些含有目的片段的產(chǎn)物。)在一系列不同的退火溫度下用特異性單引物1分別進(jìn)行了60個(gè)循環(huán)的PCR，接著

14、把在不同退火溫度下獲得的PCR產(chǎn)物合并后用特異引物2作為測(cè)序引物共同進(jìn)行測(cè)序。 對(duì)人類基因組0D44座位步行的結(jié)果證明這種方法是可靠的，他們還用這種方法克隆了人類TCRBV2S1基因的啟動(dòng)子序列，所使用的引物中大約有50能夠在某一溫度下產(chǎn)生大量含有目的序列的產(chǎn)物，并且可以用特異引物2進(jìn)行測(cè)序。與其它方法相比，這種方法速度快、不需要在多個(gè)電泳條帶中篩選目的片段和克隆。協(xié)讒卻妥蛇考緬曉冠舵旺邁道還紫廟岳由喉葦錫檀瞎昆星易他筐拾匣醞謙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù) Parker等發(fā)現(xiàn)只要在3末端最后2個(gè)堿基可以正確配對(duì)并且3末端具有部分的同源性，引物不但可以在特異的靶序列而且也

15、可以在非特異序列啟動(dòng)PCR，一個(gè)符合上述要求的引物即使有50的堿基發(fā)生錯(cuò)配仍然可以有效的誘導(dǎo)延伸反應(yīng)。他們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了TGWPCR(Targeted Gene Walking PCR). 在TGWPCR中除了兩個(gè)特異性的嵌套引物外，還需要一組已知與模板DNA有多個(gè)雜交位點(diǎn)的步查引物。先以完整的基因組DNA為模板，用特異引物分別與不同的步行引物配對(duì)進(jìn)行一組平行的PCR反應(yīng)。之后以上述每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，用帶有放射性標(biāo)記的嵌套引物和相應(yīng)的步查引物進(jìn)行嵌套PCR。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)放射自顯影檢測(cè)后從凝膠中回收帶有標(biāo)記的條帶,再一次擴(kuò)增，產(chǎn)物直接測(cè)序.紛刊衙腿眩晝汗呆愿磷術(shù)碟柵惟蔽辜控貝庸桿

16、適瓦蹤喬摻巨薄粱遼胳容柯基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用隨機(jī)引物的染色體步查技術(shù) 很早就有用隨機(jī)引物進(jìn)行染色體步查的技術(shù)，但是由于無(wú)法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，這類方法末得到廣泛應(yīng)用.劉耀光等提出的TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)巧妙的解決了這個(gè)問(wèn)題。朽具輥稗炳遠(yuǎn)鍛志諒碑粗號(hào)墊嗡逼眩才揖圾動(dòng)魚(yú)去車迭邁靖榷茍傈南嫡絨基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行的PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：由特異引物和隨機(jī)引物共同延伸產(chǎn)生的I型產(chǎn)物由特異引物單獨(dú)延伸生成的II型產(chǎn)物

17、兩端由隨機(jī)引物延伸生成的III型產(chǎn)物。其中I、II型產(chǎn)物中的非特異性產(chǎn)物可以用嵌套特異引物進(jìn)行嵌套PCR除去。III型產(chǎn)物則不能，因此是PCR中主要的背景。 TAIL-PCR用特殊的熱循環(huán)程序使PCR反應(yīng)有利于I型產(chǎn)物的擴(kuò)增，而抑制III型非特異性產(chǎn)物。這種策略的關(guān)鍵是TAIL-PCR中使用的較長(zhǎng)的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，由于兩種引物的退火溫度有明顯的差異，這樣就可以通過(guò)控制PCR循環(huán)中的退火溫度決定在PCR反應(yīng)中何種引物能夠占優(yōu)勢(shì)，從而控制不同類型產(chǎn)物的生成。遏墮容毖敷浩值擊入篆弊李帝越類翱鋤喲甭絹蔭插逐撼速恿鋪戎鋁升玩囪基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)在之后的擴(kuò)增中高嚴(yán)謹(jǐn)度和中嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯(cuò)進(jìn)行，如此重復(fù)這樣的交錯(cuò)循環(huán)，可以使目的序列的擴(kuò)增大大超過(guò)非特異性產(chǎn)物，從而控制持異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物的生成比例。兩端都由特異引物延伸而成的II型產(chǎn)物是由特異引物的錯(cuò)配產(chǎn)生的，這種產(chǎn)物雖然極具競(jìng)爭(zhēng)性，但是在第二和第三次反應(yīng)中可以用嵌套特異引物剔除。淫肌澗夜?jié)i槐尼壹鋸褥廂誣驕外棠箔臥遙毆億挖云肥碴美喪醇癱糞省槳紐基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)雍事澳疾久擒屎琶肄強(qiáng)