新生大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)

1、新生大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)【摘要】目的：討論新生大鼠心肌細胞的別離和培養(yǎng)方法。方法：應(yīng)用0.0625%的胰蛋白酶重復消化出生第2d乳鼠的心肌組織屢次,搜集的細胞用含10%胎牛血清的de培養(yǎng)基中和，用差速貼壁別離法別離，在以溴脫氧尿嘧啶brdu純化心肌細胞后置2培養(yǎng)箱孵育7d。結(jié)果：別離1只乳鼠獲得的心肌細胞產(chǎn)量約為140萬個，且有活力心肌細胞占90以上；培養(yǎng)46h的乳鼠心肌細胞開場貼壁生長,1224h明顯增殖,34d后細胞交融成片；心肌細胞由圓形變?yōu)樗笮?、星形、多角?并出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性搏動。結(jié)論：本研究應(yīng)用的心肌細胞原代培養(yǎng)方法可獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細胞，是一種可靠的心肌細胞培養(yǎng)方法?！?/p>

2、關(guān)鍵詞】心??；細胞培養(yǎng)技術(shù)；大鼠priaryulturefnenaterattusardiyte/afang|fang，shenxia|li，linli|fang，hanli|li/hinesejurnalfardivasularrehabilitatinediine,2022，182:125authrsaddress：fujianprvinialhspital，fujianedialuniversity，fuzhu,fujian,350001，hinakeyrds：yardiu;ellulturetehniques;rat自1960年haray等1首次對乳鼠的心肌細胞進展培養(yǎng)以來，國內(nèi)、外許

3、多學者對心肌細胞原代培養(yǎng)方法進展了研究。體外培養(yǎng)的心肌細胞可以保持其在體內(nèi)原有的許多構(gòu)造和功能，同時排除了神經(jīng)、體液等因素的干擾，因此體外培養(yǎng)在心肌細胞的生長、發(fā)育、生理、代謝、病理等研究中具有重要意義。然而心肌細胞在別離過程中易受損傷,活細胞也很少分裂，且不易傳代,因此進步心肌細胞產(chǎn)量和活力是許多學者研究的目的。本實驗參照sipsnp等2心肌細胞的培養(yǎng)方法并作了改良，討論了乳鼠心肌細胞培養(yǎng)的方法，對心肌細胞形態(tài)、搏動狀況進展觀察，并對其純度進展了鑒定，從而獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細胞。1資料與方法1.1材料實驗動物：選擇出生第2d的sd乳鼠,雌雄不拘由福建省醫(yī)學科學研究所實驗動物中心提供。主

4、要儀器與試劑:二氧化碳培養(yǎng)箱，lypus倒置顯微鏡,超凈工作臺，低速自動平衡離心機,恒溫磁力攪拌器;de培養(yǎng)基(hyln公司)、胎牛血清(hyln公司)、胰蛋白酶(gib公司)、d-hanks液(hyln公司)、溴脫氧尿核苷(brdu，siga公司)、小鼠抗大鼠sarerieatin單抗(博士德公司)；山羊抗小鼠igg(博士德公司)。1.2方法1.2.1心肌細胞的別離:取第2d的sd乳鼠，無菌條件下開胸取心尖部，用預冷的d-hanks液洗滌3遍，將心臟剪成約13大??；用0.0625的胰酶在37恒溫磁力攪拌器中消化心肌組織，消化過程中采用分次消化時間(5in5次,6in5次,7in5次,8in5

5、次)，第一次消化后自然沉淀并棄上清，以后自然沉淀后取上清；每次別離的上清液加等量含10胎牛血清的de培養(yǎng)液輕輕吹打制成細胞懸液，1000r/in離心10in，重復3次。1.2.2心肌細胞的培養(yǎng):細胞懸液放2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90in后，采用差速貼壁別離技術(shù),吸收培養(yǎng)瓶中的細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5.0105細胞/l，將單細胞懸液接種于培養(yǎng)板中，前3d滴入brdu使其終濃度為0.1l/l，并繼續(xù)培養(yǎng)；24h后換液,以后隔日換液。1.2.3心肌細胞搏動率的觀察:在倒置顯微鏡下觀察第1d至第7d心肌細胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化，并攝像記錄自發(fā)搏動頻率。隨機計數(shù)培養(yǎng)至第4d的心肌細胞的搏動率。細胞搏動率()=搏動

6、細胞數(shù)細胞總數(shù)100。1.2.4心肌細胞存活率的測定:取一樣量的0.4臺盼藍液與細胞懸液混勻后再取適量混合液滴于細胞計數(shù)板上，隨機取10個高倍20視野計數(shù)4個大格中的細胞總數(shù)及未染成藍色的活細胞數(shù)，計數(shù)10次，取平均值。細胞存活率()=活細胞數(shù)細胞總數(shù)100.2結(jié)果2.1消化時間對心肌細胞活力和細胞產(chǎn)量的影響實驗結(jié)果顯示,采用0.0625%胰蛋白酶、37恒溫低速磁力攪拌及分次消化時間為8in時心肌細胞活力和細胞總數(shù)較理想，見圖1，圖2。并且隨著總消化時間的延長，細胞活力程下降趨勢,見圖3。2.2培養(yǎng)心肌細胞的形態(tài)特征培養(yǎng)46h后,在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細胞開場貼壁生長,初為圓形,后為梭形,

7、偶見單個細胞開場搏動,繼而細胞逐漸在瓶壁外表鋪展；隨后細胞不斷分裂、增殖,數(shù)量逐漸增多,形成不規(guī)那么的星形,細胞鋪展狀況更加明顯,并伸出偽足；在培養(yǎng)第34d,偽足可互相接觸交織成網(wǎng),形成細胞單層或細胞簇,呈放射狀排列的同心圓狀,其搏動同步化,形成所謂功能性合體細胞，見圖4圖7見封三；至第4d自發(fā)搏動達頂峰，搏動率為8590；至第7d搏動率開場減少。2.3心肌細胞純度的鑒定橫紋肌肌動蛋白(a|atin)單克隆抗體作為一抗，用sab法進展免疫細胞化學染色，可見胞漿呈棕黃色染色；非心肌細胞染色呈陰性。結(jié)果顯示幾乎所有的細胞呈現(xiàn)陽性,說明此時培養(yǎng)的心肌細胞較純，見圖8見封三。3討論心肌細胞培養(yǎng)能提供單

8、個細胞的同源性集落，在可視、可控制的環(huán)境中對心肌細胞的特性、藥理、病理、生理、代謝和分子生物學等方面進展根底研究，具有產(chǎn)量大，重復性好及不受神經(jīng)、體液因素影響的特點，已成為心血管研究的根本方法和手段之一，有著廣闊的應(yīng)用前景。由于各實驗室所需要解決的問題、實驗材料的取舍、實驗室詳細條件不同等,所采用的細胞培養(yǎng)方法也不盡一樣。本研究采用0.0625%低濃度胰蛋白酶、37恒溫低速磁力攪拌及短時間屢次消化的方法別離新生大鼠心肌組織,以獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細胞?，F(xiàn)對新生大鼠心肌細胞體外培養(yǎng)的影響因素進展總結(jié),以進步心肌細胞培養(yǎng)的存活率。消化酶種類的選擇：別離心肌細胞通常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶3，也

9、有在胰蛋白酶或膠原酶中參加脫氧核糖核酸酶dnase4，目的是防止從損傷細胞中釋放的dna積聚。而本實驗室通過單獨用胰蛋白酶消化得到較高質(zhì)量的細胞，節(jié)省了實驗本錢。消化酶濃度和消化時間的選擇：新生大鼠心肌細胞對酶消化極為敏感，因此消化酶的濃度和消化時間是實驗成功的關(guān)鍵。不同的實驗室采用胰酶的濃度從0.050.25不等，本實驗室采用0.0625的胰蛋白酶濃度能獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細胞。胰蛋白酶濃度過高時,心肌組織中細胞及間質(zhì)均受到影響,極易把組織消化成為透明粘稠狀液體,使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細胞死亡率增加或喪失貼壁才能及搏動才能；胰蛋白酶濃度過低時，心肌組織消化缺乏，細胞聚集成團，無法分清細胞邊

10、界，難以進展形態(tài)學觀測。不同實驗室采用的分次消化時間從58in不等，我們在試驗中發(fā)現(xiàn)分次消化時間為8in時，細胞產(chǎn)量和細胞活力較理想。有的實驗室在心肌消化過程中將心肌消化到透明為止，而我們發(fā)現(xiàn)隨著總消化時間的延長細胞活力呈下降趨勢，本實驗室將總的消化時間控制在20in左右。細胞培養(yǎng)過程中的無菌原那么：在進展細胞培養(yǎng)時,組織材料來源、培養(yǎng)液、血清、消化酶、手術(shù)器械、培養(yǎng)板等,要嚴格按無菌實驗要求準備,培養(yǎng)過程中詳細操作的每一步都應(yīng)嚴格遵循實驗原那么和無菌要求。心肌細胞的觀察、拍照時間不可過長，頻率不可太高，否那么能增加污染概率。心肌細胞生長適宜的ph值：心肌細胞生長的最適ph值為7.27.4，因

11、此培養(yǎng)液、胰蛋白酶、d-hanks液ph值均應(yīng)在此范圍內(nèi)。當ph低于6.8時,對心肌細胞生長會有抑制作用；當ph值大于7.6時，心肌細胞生長亦會受到抑制，且搏動會減弱。成纖維細胞對心肌細胞培養(yǎng)的影響：細胞培養(yǎng)中的非心肌細胞主要是成纖維細胞，成纖維細胞較心肌細胞更容易貼壁且具有分裂增殖才能，大量成纖維細胞的存在不僅限制心肌細胞的活動,而且其分泌物也影響心肌細胞的形態(tài)構(gòu)造和生理功能5。本實驗采用90in差速貼壁和brdu可得到較純的心肌細胞。brdu可顯著抑制心肌細胞中的成纖維細胞,并發(fā)現(xiàn)brdu對心肌細胞無毒性與抑制作用,可使培養(yǎng)細胞中心肌細胞所占比例從4550進步到85906。心肌細胞的接種密

12、度：心肌細胞的接種密度不僅影響別離細胞的分化表型特征,而且影響心肌細胞的生存時間。心肌細胞之間聯(lián)絡(luò)可促進細胞自發(fā)活動的形成。假如心肌細胞接種密度太低,細胞間難進展信息交流,細胞生長不良、細胞難于生存；假如細胞密度太高,那么易發(fā)生營養(yǎng)不良，且許多細胞難于貼壁生長,在更換培養(yǎng)液時容易被喪失7。本實驗室的心肌細胞接種密度一般為5105細胞/l,此時細胞生長良好,收縮明顯而有力,搏動頻率多在70120次/in。綜上所述，心肌細胞增殖才能低，大多實驗來源于心肌細胞的原代培養(yǎng)，因此原代培養(yǎng)的成功與否直接關(guān)系到實驗的進程，而進步心肌細胞的產(chǎn)量和活力是心肌細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本研究介紹的心肌細胞原代培養(yǎng)方法，

13、細胞貼壁快、搏動早、產(chǎn)量高，活力好而且操作簡便、本錢低，是一種較為理想的心肌細胞原代培養(yǎng)方法?！緟⒖嘉墨I】1hararyl，farlyb.invitrstudiesfsingleislatedbeatingheartellsj.siene,1960，131:1674-1675.2sipsnp，savins.differentiatinfratyytesinsingleellulturesithandithutprliferatingnnyardialellsj.irares，1982，50：101-106.3suzukit，hta，hshh.serufree，heiallydefinededi

14、utevaluatethedireteffetsfgrthfatrsandinhibitrsnprliferatinandfuntinfnenatalratardiausleellsinulturej.invitr，1989，25：601-606.4bera，vandereesg，ndergej，etal.separatinfnenatalratventriularyytesandnn|yytesbyentrifugalelutriatinj.eurj，phy，2002，444(3)：452-456.5iragli，gaudesiusg，rhrs.eletrtnidulatinfardiaipulsendutinbyyfibrblastsj.irares，2022，98(6)：801-810.6sunh，hartierd，leblann，raellularaliuh