生化分析方法(熊)

1、指導(dǎo)老師：張宏姓名：熊昱生化分析簡(jiǎn)述1什么叫生化分析什么叫生化分析，我們可以這樣理解：用生物、化學(xué)的原理和方法，研究生命現(xiàn)象的分析方法。研究生物體的化學(xué)組成、代謝、營養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子病等等，闡明生命現(xiàn)象。 2生化分析是進(jìn)行生命科學(xué)研究的一個(gè)重要手段，在生物醫(yī)藥研發(fā)、臨床生化診斷、生化產(chǎn)品生產(chǎn)等領(lǐng)域起著越來越重要的作用，是一門理論與實(shí)踐相結(jié)合的綜合性技術(shù)。3發(fā)展進(jìn)程從早期對(duì)生物總體組成的研究。進(jìn)展到對(duì)各種組織和細(xì)胞成分的精確分析。目前正在運(yùn)用諸如光譜分析、同位素標(biāo)記、X射線衍射、抗原抗體反應(yīng)、酶交聯(lián)的免疫吸附法、其他物理學(xué)、化學(xué)技術(shù)，對(duì)重要的生物大分子（如蛋白質(zhì)、

2、核酸等）進(jìn)行分析，以期說明這些生物大分子的多種多樣的功能與它們特定的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)4對(duì)不同的對(duì)象，有不同的分析方法，要達(dá)到不同的目的，也要使用不同的分析方法，因此分析方法也就多種多樣，在這里我就講蛋白質(zhì)的分析方法概述，拋磚引玉5氨基酸蛋白質(zhì)的分析方法生物體中廣泛存在的一類生物大分子，由核酸編碼的氨基酸之間通過氨基和羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經(jīng)翻譯后加工而生成的具有特定立體結(jié)構(gòu)的、有活性的大分子。泛指某一類蛋白質(zhì)，與前面的限定詞組成復(fù)合詞時(shí)，一律用“蛋白質(zhì)”，如血漿蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)、酶蛋白質(zhì)等，此時(shí)“質(zhì)”字不得省略(習(xí)慣詞除外，新命名者從此)。凡指具體蛋白質(zhì)時(shí)，“質(zhì)”字可省略，如血紅蛋白、肌球

3、蛋白等。 蛋白質(zhì)四聚體(四級(jí)結(jié)構(gòu))61.氨基酸類藥物分析 藥典中氨基酸含量測(cè)定大多應(yīng)用化學(xué)滴定法,只有美國藥典中乙酰半胱氨酸采用高教液相色譜法( HPLC ) 。但近年來HPLC已廣泛應(yīng)用于氨基酸分析,其中令人關(guān)注的是有關(guān)氨基酸的衍生化，因?yàn)橹挥袠O少數(shù)氨基酸具有紫外吸收,大多數(shù)氨基酸不能用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。為改善被測(cè)物的 檢測(cè)特性，提高檢測(cè)靈敏度，必須采用化學(xué)衍生法。目前衍生方法大致有兩種 ： 柱前衍生和柱后衍生。71.1柱前衍生法柱前衍生法是將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌镌龠M(jìn)行HPLC分離，衍生化的結(jié)果不僅僅改善了被測(cè)物的檢測(cè)特性，有時(shí)對(duì)其色譜分離也有一定的幫助 ，常用 衍生化試劑有鄰苯二 甲醛、羥基

4、琥珀酸亞胺一 吲哚乙酸(SIIA)、苯氨基硫代甲酰酯(PTC)。有科學(xué)家分別用亞硝酸和 N 芘基馬來酰亞胺作為衍生化試劑以紫外和熒光作檢測(cè)的反相高效液相法(R PHPLC) 定量測(cè)定人體內(nèi)乙酰半胱氨酸，獲得到滿意結(jié)果。81.2柱后衍生法柱后衍生法是將樣品先經(jīng)色譜柱分離， 柱后再進(jìn)行衍生。Nozal等將乙酰半胱氨酸經(jīng)RPHPLC分離后，用二硫硝基苯酸衍生處理再進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)加入溴化十六烷基三 甲銨陽離子以增強(qiáng)靈敏度，檢測(cè)限為0.6g 。得到了滿意的結(jié)果91.3其他衍生方式除了以上兩種經(jīng)典衍生方式外，最近有文獻(xiàn) “介紹了用于定量分析氨基酸的一種毛細(xì)管柱內(nèi)衍生方法，可在緩沖液中加入衍生劑(Onli

5、ne法)， 也可在毛細(xì)管前端的衍生室進(jìn)行反應(yīng)(Sandwich法)，這種方法與柱前衍生法檢測(cè)水平相當(dāng)( 微克級(jí)) 此外， 還可用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器直接檢測(cè)非衍生化的氨基酸，配合HPLC的分離定量， 檢測(cè)限達(dá) 納克級(jí) ， 回收率為9 4%10112 酶類分析 酶的種類極多， 目前研究發(fā)現(xiàn)的酶已達(dá) 1300多種，它們都是機(jī)體細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)，具有高度的催化作用及選擇性；雖為活體產(chǎn)生，但 自活體提出后 ，仍不失其催化活性個(gè)，因此某些酶經(jīng)提取后，可作 為藥用。 現(xiàn)有藥用酶制劑已達(dá)100種， 。 12酶類藥物分析基本上還是應(yīng)用生化反應(yīng)方法，生化物質(zhì)為底物，輔以紫外分光光度法 (UV) ，反映酶解反應(yīng)的程

6、度 ， 測(cè)定酶效價(jià)。映酶解反應(yīng)的程度 ， 近年來， 人們嘗試用一些新的生化反應(yīng)底物使反應(yīng)更加靈敏和準(zhǔn)確 13超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內(nèi)超氧陰離子清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD廣泛存在于各類生物體內(nèi)，所有好氧微生物細(xì)胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次發(fā)現(xiàn)了SOD生物活性后，醫(yī)學(xué)界對(duì)其醫(yī)療作用做了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用，被專家稱為21世紀(jì)最有前途的藥用酶。歐美國家已開始將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健、化妝品等領(lǐng)域。14【酶活測(cè)

7、定】在25 4.5ml 50mmolL pH8.3的K2HPO4- KH2PO4緩沖液中加入待測(cè)SOD樣液，再加入10ul 50mmolL的連苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑lcm 的比色杯，在325nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)一次A值。同時(shí)測(cè)定Sigma公司的SOD標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)所測(cè)樣品SOD活性進(jìn)行校正?！久富疃x】在1ml反應(yīng)液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50時(shí)的酶量為一個(gè)酶活單位， 即325nm 0.035ODmin為一個(gè)酶活單位。1516Jones應(yīng)用硫代氨基甲酰-酪蛋白熒光底物使胰蛋白酶、胃蛋白酶的檢測(cè)靈敏度提高了幾十倍；張東裔等以對(duì)甲苯磺?；彼峒柞?TAME ) 為底物，以 苯酚紅指示

8、劑在特定波長(zhǎng)下光吸收值的變化作為測(cè)定胰蛋白酶效價(jià)的指標(biāo)， 相對(duì)于藥典中以消耗氫氧化鈉體積為指標(biāo)，這種方法更加簡(jiǎn)便靈敏；此外， 通 過選擇不同的底物和指示劑 ， 此法還 可用于測(cè)定其 它蛋白酶的活性 ， 從而建立一 系列以指示劑為基礎(chǔ)的酶活性測(cè)定方法。17183 蛋白質(zhì)多肽類藥物分析 3.1蛋白質(zhì)印記法，英文名：（Western blotting ）一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。即將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用標(biāo)記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜上特定的蛋白條帶 193.2酶聯(lián)免疫法，簡(jiǎn)稱ELISA酶聯(lián)免疫法，簡(jiǎn)稱ELISA。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后

9、通過顯色來檢測(cè)。 203.3單克隆抗體檢測(cè)法單克隆抗體檢測(cè)法。一般用制好的單克隆抗體試劑盒來檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確213.4免疫組化免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。223.5熒光光譜法熒光光譜法靈敏度高，復(fù)雜組分辨識(shí)度好，作為一種常規(guī)的檢測(cè)手段在生物傳感方面發(fā)揮著其優(yōu)勢(shì)，是定量測(cè)定蛋白質(zhì)的常用

10、方法。常用的幾種方法是內(nèi)源熒光法、熒光探針法、熒光偏振、時(shí)間分辨熒光法及激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨免疫分析法。233.51內(nèi)源熒光法內(nèi)源熒光法是基于蛋白質(zhì)中存在著酪氨酸和色氨酸，能夠吸收270-300nm的紫外光而發(fā)出紫外熒光發(fā)展起來的61, 62。當(dāng)測(cè)定體系中加入小分子配體(SM)時(shí)，SM與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光的碎滅，利用SM對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的碎滅這一現(xiàn)象可以確定蛋白質(zhì)與SM的作用類型及其結(jié)合部位等。此法比紫外分光光度法靈敏，且核酸的干擾較小，來自其他小分子化合物的干擾也比較小。243.52外源熒光法對(duì)于蛋白質(zhì)的研究?jī)H利用其內(nèi)源熒光是不夠的，需要通過外源熒光性質(zhì)的研究才能獲得更多關(guān)于蛋

11、白質(zhì)分子的各種信息，這就使得熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)分析有著重要的意義，這已成為蛋白質(zhì)微量檢測(cè)及溶液的構(gòu)相分析中的手段之一。作為一個(gè)好的熒光探針應(yīng)滿足以下條件探針分子與蛋白質(zhì)分子的某一微區(qū)必須有特異性的結(jié)合，并且結(jié)合比較牢固;探針的熒光必須對(duì)環(huán)境條件敏感;蛋白質(zhì)分子與探針結(jié)合后不影響其原來的結(jié)構(gòu)和特性。在外源熒光法中，又可分為熒光增強(qiáng)法和熒光碎滅法。253.53熒光偏振法利用熒光體在轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散速度上的差異而導(dǎo)致偏振熒光的差別，建立了熒光偏振測(cè)定法。利用熒光偏振我們可以研究:(1)酶與熒光底物的結(jié)合程度;(2)蛋白質(zhì)聚合與解離;(3)蛋白質(zhì)從螺旋到無規(guī)則卷曲的研究。另外還可得到一些通常由圓二色譜和紫外可見

12、分光光度計(jì)得不到的有關(guān)蛋白質(zhì)柔性微區(qū)的信息263.54時(shí)間分辨熒光光譜法時(shí)間分辨熒光光譜是依據(jù)待測(cè)組分熒光衰減特性的差異而進(jìn)行選擇性測(cè)定，可以消除瑞利和拉曼散射的干擾，又可以根據(jù)熒光壽命的差異對(duì)熒光光譜重疊組分進(jìn)行測(cè)定，為復(fù)雜體系的熒光測(cè)量提供了選擇性基礎(chǔ)。時(shí)間分辨一熒光免疫分析以具有較長(zhǎng)熒光壽命的熒光基團(tuán)作為免疫標(biāo)記，利用時(shí)間分辨熒光測(cè)量技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。一方面可以在熒光分子定量中獲得高靈敏度，另一方面可以通過時(shí)間分辨技術(shù)使選擇性得到改善，這樣就可以定性和定量分析微量蛋白質(zhì)。273.55激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨免疫分析法在稀土配合物時(shí)間分辨熒光光譜和免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨免疫分析法在

13、靈敏度、專一性、穩(wěn)定性等方面均可與放射免疫分析相媲美，是超微量蛋白質(zhì)免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白G的測(cè)定。 284儀器分析由于科學(xué)的發(fā)展，各種物理化學(xué)手段的不斷提高，許多科學(xué)儀器被制作出來，大量復(fù)雜的、精確的操作都有科學(xué)儀器來完成294.1生化分析儀光電比色原理來測(cè)量體液中某種特定化學(xué)成分的儀器。由于其測(cè)量速度快、準(zhǔn)確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)已在各級(jí)醫(yī)院、防疫站、計(jì)劃生育服務(wù)站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗(yàn)的效率及收益。304.11功能及特點(diǎn) 自動(dòng)生化分析儀是將生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、保溫、比色、結(jié)果計(jì)算、書寫報(bào)告和清理等步驟的部分或全部由模仿手工操

14、作的儀器來完成。它可進(jìn)行定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法等各種反應(yīng)類型的分析測(cè)定。除了一般的生化項(xiàng)目測(cè)定外，有的還可進(jìn)行激素、免疫球蛋白、血藥濃度等特殊化合物的測(cè)定以及酶免疫、熒光免疫等分析方法的應(yīng)用。它具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化、微量等特點(diǎn) 314.12幾種生化分析儀流動(dòng)式自動(dòng)生化分析儀空氣分段系統(tǒng)流動(dòng)式自動(dòng)生化分析儀非分段系統(tǒng)分立式自動(dòng)生化分析儀SHF-1型半自動(dòng)生化分析儀 324.13蛋白質(zhì)分析全自動(dòng)凱氏定氮儀（國家發(fā)明專利號(hào)ZL2.7） 33使用世界上領(lǐng)先的顏色傳感器技術(shù)判定滴定終點(diǎn)技術(shù)，該技術(shù)與光電管檢測(cè)方式相比具有終點(diǎn)判斷精確、抗干擾能力強(qiáng)、壽命長(zhǎng)、無需將滴定系統(tǒng)置于暗室，操作與觀察方便等顯著的優(yōu)點(diǎn);與電位滴定檢測(cè)方式相比具有滴定終點(diǎn)無溫度漂移，無需預(yù)熱與校準(zhǔn)等明顯優(yōu)勢(shì)。 設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，選材嚴(yán)格，確保測(cè)試高精度與高回收率 PC化，網(wǎng)絡(luò)化優(yōu)勢(shì)，儀器具有RS232接口(標(biāo)配)與無線藍(lán)牙接口(選配)，連接電腦由配套的專用數(shù)據(jù)處理軟件自動(dòng)生成測(cè)試信息和全面的檢測(cè)報(bào)告,并有增強(qiáng)型的計(jì)算機(jī)控制軟件可供選購.34k05A自動(dòng)定氮儀（專利申請(qǐng)?zhí)?.7） 35主要特點(diǎn)：.采用國標(biāo)規(guī)定的檢驗(yàn)方法 .大屏幕LCD顯示屏，人