熒光分析一節(jié)課件

1、熒光分析技術(shù)在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用 盧建忠藥學(xué)院藥物分析教研室分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。理論課部分熒光分析導(dǎo)論）熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系環(huán)境因素對(duì)熒光光譜和強(qiáng)度的影響溶液熒光的淬滅熒光儀器熒光分析法熒光在環(huán)境和生物中的應(yīng)用熒光在免疫和細(xì)胞分析中的應(yīng)用單細(xì)胞納米熒光分析基因芯片熒光分析實(shí)驗(yàn)部分稀土離子銪的測(cè)定熒光仿生膜技術(shù)研究中藥活性成分跨膜熒光共振能量轉(zhuǎn)移氨基酸HPLC熒光分析熒光免疫分析或DNA分析室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，這

2、種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。概述 光的現(xiàn)象早已為人們所認(rèn)識(shí)：某些化合物受到太陽(yáng)光的照射，會(huì)發(fā)光；一些昆蟲(chóng)會(huì)發(fā)光。文獻(xiàn)記載：1500-1000 B.C., 螢火蟲(chóng)發(fā)光。1605年，F(xiàn)rancis Bacon，比較詳細(xì)地：只有螢火蟲(chóng)活著時(shí)，才會(huì)發(fā)光 固體發(fā)光文獻(xiàn)記載, 意大利文藝復(fù)興時(shí)期, 大約1600年, Bolonian鞋匠煉金術(shù)士(Vincencio casciarolo), 經(jīng)炭火煅燒過(guò)的高粘度磚石（Monte Paterno）, 若太陽(yáng)照射,放置于暗處,會(huì)發(fā)紅光。Called as “Bolonian stones” or “Moonstones”（月長(zhǎng)石）-讓人們著迷兩個(gè)世紀(jì)，calledas

3、“Phosphore”-第一塊無(wú)機(jī)人工磷光石。 月長(zhǎng)石的發(fā)現(xiàn)首先吸引了Galileo（1564-1642年）和他的同事們的興趣。因?yàn)榱坠馐诠庹丈渲安粫?huì)發(fā)光，他們認(rèn)為只有光進(jìn)入石頭之后才會(huì)發(fā)光，類似于海綿吸水，所以他們把這種現(xiàn)象稱為“光海綿”，磷光石的行為就意味著時(shí)間光保存在某種物質(zhì)中的時(shí)間。 1652年，意大利數(shù)學(xué)家ucchi發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光照射后的磷光石發(fā)強(qiáng)光，而且發(fā)射光的顏色不隨照射光的顏色改變而改變。因此ucchi認(rèn)為：物質(zhì)吸收光并不象海綿吸水一樣，僅僅將光儲(chǔ)存在物質(zhì)中，然后毫無(wú)改變的釋放出來(lái)。是磚石中的某些物質(zhì)“靈魂”，在光照射的過(guò)程中發(fā)生了改變，當(dāng)光照射停止后，這些物質(zhì)產(chǎn)生的光逐漸衰減。

4、這種延遲的發(fā)光現(xiàn)象，現(xiàn)在已被證實(shí)為磷光。發(fā)光本質(zhì)：BaSO4-Bi-Mn 硫酸鋇 鉍 錳煅燒石SO42- - S堿土金屬的化合物中摻雜了重金屬離子后，引起晶體結(jié)構(gòu)的變化，致使發(fā)光加強(qiáng)。 amburg的一位化學(xué)家ennigrand用“Phosphor”這個(gè)單詞來(lái)描述化學(xué)元素“磷”。rand一直在尋找“點(diǎn)金石”，發(fā)現(xiàn)砂子與尿的蒸餾物中有一種物質(zhì)能夠在暗處發(fā)光，他將這種物質(zhì)命名為“randsphosphor”，其實(shí)這就是單質(zhì)“”，這并不同于以往的“Phosphor”，這是因?yàn)?化學(xué)發(fā)光 著名科學(xué)家tokes提出“fluorescence”概念，描述熒光是一種光的發(fā)射過(guò)程，并發(fā)明一項(xiàng)技術(shù)，使用濾光片觀

5、察到了硫酸奎寧的熒光，而且闡述了“tokesaw”，也就是發(fā)射光的波長(zhǎng)大于激發(fā)光的波長(zhǎng)。他最先闡明熒光強(qiáng)度與濃度在一定范圍之內(nèi)成正比。濃度高時(shí)熒光會(huì)發(fā)生自淬滅；外來(lái)離子的存在也會(huì)引起熒光的淬滅。19世紀(jì)五十年代，由英國(guó)皇家學(xué)會(huì)的Stocks院士才真正闡述清楚熒光是怎樣發(fā)生的。硫酸奎寧溶解在稀硫酸里，放到一個(gè)瓶子里，然后用太陽(yáng)光來(lái)照這個(gè)溶液，但不是直接照射，而是在當(dāng)中用一塊教堂窗上藍(lán)色的玻璃（能透過(guò)400納米以下的短波長(zhǎng)的光紫外光），也就是說(shuō)，用太陽(yáng)光中的紫外光或者近紫外光來(lái)照射奎寧硫酸溶液，中間還放置一個(gè)黃色的葡萄酒，這杯酒起到的作用是能把400納米以上的光都濾掉，只允許400納米以下的光透過(guò)

6、，他就在90度的角度上來(lái)觀察，這樣他就能很清楚地看到，奎寧在用400納米以下的光照射時(shí)，或者講在激發(fā)時(shí)，發(fā)出的是藍(lán)色的光，藍(lán)色光的波長(zhǎng)要比紫外光的波長(zhǎng)長(zhǎng)。因此Stocks就第一個(gè)把熒光發(fā)生的過(guò)程的道理很清楚的講出來(lái)了，而且發(fā)射波長(zhǎng)要比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)，我們把波長(zhǎng)之間的差叫作Stocks位移(Stocks shift)，以次紀(jì)念他的貢獻(xiàn)。實(shí)際上這個(gè)裝置就是最原始的熒光儀器，這就是原始創(chuàng)新。 硫酸奎寧-用于治療耐氯喹和耐多種藥物蟲(chóng)株所致的惡性瘧。也可用于治療間日瘧。 硫酸奎寧:本品為白色細(xì)微的針狀結(jié)晶，輕柔，易壓縮；無(wú)臭，味極苦；遇光漸變色；水溶液顯中性反應(yīng)。本品在氯仿無(wú)水乙醇(2:1) 的混合液中易溶

7、，在水、乙醇、氯仿或乙醚中微溶。比旋度為-237至-244。金雞納霜 （Quinine ）：是防治熱病，尤其是內(nèi)瘧疾的特效藥，為熱帶地區(qū)的必需品 。金雞納霜是用金雞納樹(shù)的樹(shù)皮研磨而成的。 硫酸奎寧和硫酸依替米星區(qū)分原理：硫酸奎寧加水溶解后，加稀硫酸使成酸性，即顯藍(lán)色熒光。而硫酸依替米星無(wú)此特性?，F(xiàn)象：肉眼即可見(jiàn)硫酸奎寧溶液有較弱的藍(lán)色熒光，而硫酸依替米星為無(wú)色透明液體。 左瓶:硫酸依替米星右瓶:硫酸奎寧紫外燈下可看見(jiàn)硫酸奎寧溶液的強(qiáng)烈藍(lán)色熒光。硫酸奎寧的鑒別實(shí)驗(yàn)綠奎寧反應(yīng)取本品約20mg，加水20ml溶解后，加溴試液3滴與氨試液1ml ，即顯翠綠色。 Fluorescence早在十六世紀(jì)就在一

8、種螢石的石頭上被人們發(fā)現(xiàn)了，螢石主要是氟化鈣，Ca常被Y和Ce等元素替代，此外還含有少量的Fe2O3 ，SiO2等，當(dāng)光照射到石頭上時(shí)它會(huì)發(fā)出綠色的光，因?yàn)槲炇挠⒄Z(yǔ)是fluorite，因此當(dāng)時(shí)英文把它改為fluorescence，就是熒光。有人講我國(guó)古代的夜明珠就是螢石?1864年，Stokes首先提出熒光作為一種分析手段測(cè)熒光一定要有儀器，Stocks發(fā)明的是第一臺(tái)最原始的儀器。我們現(xiàn)在用氙燈代替太陽(yáng)，氙燈會(huì)發(fā)出非常強(qiáng)大的寬光譜光源，然后通過(guò)一個(gè)單色儀，把氙燈發(fā)出的光分成一束一束的單色光。這里的氙燈就好比是太陽(yáng)，而單色儀就好比是教堂的玻璃片?，F(xiàn)在雖然儀器現(xiàn)代化了，但還是脫離不了Stock設(shè)

9、計(jì)的模式，只不過(guò)裝置復(fù)雜了一點(diǎn)。 能用好的儀器出好文章和成果，當(dāng)然是好事情。如果你能用一般的儀器做，而不是最先進(jìn)儀器，研究出漂亮成果，那才是真正的成就。2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Koichi Tanaka（田中耕一），在島津公司中居然也只是一個(gè)排在晉升階梯的倒數(shù)第二層的普通職員。2008年12月10日，日本理論物理學(xué)家益川敏英， ：“I am sorry I cant speak English”，開(kāi)始用日語(yǔ)講述。幾乎從來(lái)不說(shuō)英語(yǔ)，與外國(guó)同行的交流需要翻譯的幫助，而他和妻子來(lái)到斯德哥爾摩領(lǐng)獎(jiǎng)竟然是他們有生之年的第一次出國(guó)旅行！絕大多數(shù)論文都發(fā)表在日本自辦的英文專業(yè)期刊理論物理學(xué)進(jìn)展（Progr

10、ess of Theoretical Physics）熒光發(fā)展歷程第一次記錄熒光現(xiàn)象：1575年，西班牙內(nèi)科醫(yī)生、植物學(xué)家，N.Monardes,一種稱為“Lignum Nephriticum”的木頭切片的水溶液，呈現(xiàn) “天藍(lán)色” 。熒光是光發(fā)射概念、引入熒光術(shù)語(yǔ)：1852年，Stokes，觀察奎寧、葉綠素。提出用熒光作為分析手段：1864年，Stokes第一個(gè)實(shí)際應(yīng)用、鋁一桑色素?zé)晒鉁y(cè)定鋁：1867年。熒光發(fā)展歷程1880年，Liebeman提出最早的關(guān)于熒光與化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)法則。19世紀(jì)末，已知包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光化合物。20世紀(jì)以來(lái)，熒光現(xiàn)象被研究的更多了。

11、如：1905年Wood發(fā)現(xiàn)了共振熒光；1914年Frank和Hertz利用電子沖擊發(fā)光進(jìn)行定量研究；1922年Frank和 Cario發(fā)現(xiàn)了增感熒光；1924年Wawillous進(jìn)行了熒光產(chǎn)率的絕對(duì)測(cè)定；1926年Gaviola進(jìn)行了熒光壽命的直接測(cè)定等。熒光發(fā)展歷程19世紀(jì)以前，肉眼觀察。1928年，Jette和West提出了第一臺(tái)光電熒光計(jì)，靈敏度很低。1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校正步驟。1948年Studer推出了第一臺(tái)自動(dòng)光譜校正裝置。1952年：商品化的熒光校正光譜儀器。熒光發(fā)展歷程隨著激光

12、、微處理機(jī)和電子學(xué)等科學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)了熒光分析理論的發(fā)展，許多新技術(shù)如：同步熒光測(cè)定、導(dǎo)數(shù)熒光測(cè)定、時(shí)間分辨熒光測(cè)定、相分辨熒光測(cè)定、熒光偏振測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、低溫?zé)晒鉁y(cè)定、固體表面熒光測(cè)定、熒光反應(yīng)速率法、三維熒光光譜技術(shù)、熒光傳感器.熒光分析儀器高效、痕量、微觀和自動(dòng)化發(fā)展。應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、公安情報(bào)和科學(xué)研究等領(lǐng)域。中國(guó)熒光發(fā)展歷程50年代初期僅有極少數(shù)的分析化學(xué)工作者從事熒光分析的研究。70年代后期，引起廣泛重視，第一本熒光專著熒光分析法，陳國(guó)珍教授主編，1975年4月科學(xué)出版社出版。1990年第二版熒光分析法，陳國(guó)珍、黃賢智、許金鉤等教授主編，科學(xué)出版社出版。2

13、006 年7月，許金鉤，王尊本，第三版熒光分析法，科學(xué)出版社出版。 陳國(guó)珍教授(1916-2000) 福建廈門(mén)人，1938年畢業(yè)于廈門(mén)大學(xué)化學(xué)系 ，1951年獲英國(guó)倫敦大學(xué)哲學(xué)博士學(xué)位。歷任廈門(mén)大學(xué)化學(xué)系主任、教授、校長(zhǎng)助理，第二機(jī)械工業(yè)部生產(chǎn)局總工程師、副局長(zhǎng)，國(guó)家海洋局副局長(zhǎng)。 提供質(zhì)量符合要求的鈾235材料，解決鈾-235中含量低至百萬(wàn)分之一或億分之一級(jí)的雜質(zhì)的分析問(wèn)題。 原子彈、钚彈、氫彈和核潛艇研究工作。氨基酸熒光常見(jiàn)的蛋白質(zhì)有20種氨基酸通過(guò)一定的方式組成，其中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，能產(chǎn)生熒光。這三種氨基酸都有苯環(huán)，它們各有各的特征。酪氨酸常常做無(wú)名英雄，它單獨(dú)存在或者以氨基酸

14、存在的時(shí)候，它的熒光發(fā)射能力要比色氨酸強(qiáng)的多，但在蛋白質(zhì)里同時(shí)有色氨酸和酪氨酸時(shí)，酪氨酸熒光就不出來(lái)了，只有色氨酸能發(fā)熒光。 人的血清白蛋白中只有1個(gè)色氨酸，有16個(gè)酪氨酸只能測(cè)出色氨酸的熒光。蛋白質(zhì)本身就能發(fā)出熒光的物質(zhì)叫做內(nèi)源熒光，色氨酸處于蛋白質(zhì)的位置不同，產(chǎn)生的熒光光譜也是不同的。就此，色氨酸作為報(bào)告基團(tuán)，你有什么樣的光譜反過(guò)來(lái)我們就知道色氨酸處于什么位置。比如人體內(nèi)的鈣調(diào)蛋白，它對(duì)運(yùn)輸鈣離子起重要作用，這個(gè)蛋白質(zhì)里一個(gè)色氨酸都沒(méi)有，但它有四個(gè)鈣離子結(jié)合的部位，我們?cè)诿恳粋€(gè)結(jié)合部位把氨基酸換成色氨酸，每次換一個(gè)，其余三個(gè)保持原狀，從而測(cè)出鈣離子的四個(gè)結(jié)合部位蛋白中的特點(diǎn)-色氨酸研究蛋白

15、的方法。 人體本身具有血紅蛋白，它可以把肺里的氧氣傳輸?shù)缴眢w各個(gè)部位正常人的血紅蛋白有兩個(gè)亞基和兩個(gè)亞基，但如果是血紅蛋白分子病的人，那么，他的亞基里的氨基酸發(fā)生突變，由谷氨酸變成纈氨酸，非洲人得這種鐮刀型血紅蛋白癥比較多，得了這種病以后，其紅細(xì)胞形狀改變成鐮刀狀，一般只能活到30歲左右。發(fā)生在上海的病，不是亞基出問(wèn)題，而是其亞基出現(xiàn)問(wèn)題，其中第87號(hào)氨基酸（我們稱為組氨酸）變成了酪氨酸，從而該病人的血紅蛋白攜氧能力就很弱，其病癥是嘴唇發(fā)紫、指甲發(fā)青。把四個(gè)亞基分開(kāi)，然后用生化的方法非常溫和地把鐵卟啉拿走，得到?jīng)]有輔基的蛋白亞基，從而測(cè)出是否得病。正常人的熒光壽命為12.9 ns相當(dāng)于在辛醇中

16、的壽命，而得病的人為8.0 ns相當(dāng)于在乙醇中的壽命，那么顯然得病的人其疏水能力比正常人弱的多，所以攜氧的能力就弱。外源的 1,8-ANS熒光探針，通常使用的樟腦丸柰的一種衍生物，這個(gè)探針專門(mén)結(jié)合到蛋白的“疏水部分”。1,8-ANS探針特性-與環(huán)境息息相關(guān)，比如熒光壽命，隨著疏水性能的增強(qiáng)而增強(qiáng)。 一、熒光與磷光的產(chǎn)生過(guò)程 由分子結(jié)構(gòu)理論，討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1. 分子能級(jí)與躍遷 分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜； 在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在一系列的振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)； 用S0表示基態(tài)； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 表示； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 表示； V=0,1,2

17、,3表示振動(dòng)能級(jí)。 2.電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入(見(jiàn)能級(jí)圖)； 熒光 涉及吸收和發(fā)射兩個(gè)過(guò)程 1、激發(fā)態(tài) 基態(tài) 激發(fā)態(tài) 分立軌道上 非成對(duì)電子 平行自旋更 n 穩(wěn)定 n 凈電子自旋 S=0 S=0 S=1 分子重態(tài) M=2S+1=1 （躍遷幾率很?。?M=2S+1=3 單重基態(tài) S0 激發(fā)單重態(tài) S 激發(fā)三重態(tài) T 電子從 S0 到 S 分子能量相應(yīng)增加改變了分子對(duì)稱性、 分子凈的電子自旋

18、（多重性）可能改變2.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄越振動(dòng)弛豫非輻射躍遷 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫非輻射能量傳遞過(guò)程 振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。系間竄越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。 改變電子的自旋狀態(tài)。如S1T1S

19、2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2 內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫非輻射能量傳遞過(guò)程內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度電子能級(jí)間的無(wú)輻射躍遷過(guò)程。如S2S1，T2T1。在10-1310-11s內(nèi)完成。 外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2 內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫輻射能量傳遞過(guò)程 熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（ 多為 S1 S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為 2的熒光； 10-710 -9 s 。 由

20、圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，熒光的發(fā)射波長(zhǎng)比吸收波長(zhǎng)要長(zhǎng)； 2 2 1 ；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2 內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫輻射能量傳遞過(guò)程磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（ T1 S0躍遷）； 電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（ S0 T1禁阻躍遷） S0 激發(fā)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫 T1發(fā)光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2 內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫去活化過(guò)程溶液中： 10-14-1

21、0-12 s 10-13-10-11 s 10-2-10-6 s 振動(dòng)弛豫 內(nèi)部轉(zhuǎn)換 體系間的跨越 （發(fā)生在相同多重度間） （發(fā)生在不同多重度間） S2 S1 T1(S1) T2 10-15 s A1 A2 F P 磷光發(fā)射 10-2-10 s 基態(tài) S0 熒光發(fā)射 外部轉(zhuǎn)換 10-7-10-9 s 發(fā)生在不同電子能態(tài)間 （淬滅）熒光與磷光的根本區(qū)別 熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。二、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜 熒光(磷光)：激發(fā)波長(zhǎng)如何選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 固定熒光波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化

22、合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光發(fā)射光譜(或磷光發(fā)射光譜) 固定激發(fā)波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。 在熒光和磷光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能