植物組織培養(yǎng)版

1、植物組織培養(yǎng)復(fù)習(xí)資料第一章緒論組織培養(yǎng)的類型植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用一植物組織培養(yǎng)的意義(一)定義（Definition）：植物組織培養(yǎng)（Tie culture）是指用無菌方法使植物體的離體、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（In vitro culture）。是指分離一個或數(shù)也可定義為：利用植物體的細(xì)胞或植物體的一部分在無菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。、組織或細(xì)胞，通過無菌操作接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在一定的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長發(fā)育的技術(shù)稱為植物組織培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)又俗稱植物克隆Toti

2、potency （細(xì)胞全能性）Each cell of a multicellular the whole plant.anism contains all of tes needed to form指細(xì)胞能夠發(fā)展成為一棵完整植株的潛能（二）植物組織培養(yǎng)的意義1、植物基礎(chǔ)學(xué)科研究良好系統(tǒng)2、生物技術(shù)的基礎(chǔ)3、經(jīng)濟(jì)高效、管理方便、便于自動化4、生長周期短、速度快、試驗重復(fù)性好5、技術(shù)含量高、實驗誤差小、人工控制能力強(qiáng)6、試驗材料經(jīng)濟(jì)、來源單一7、缺點：設(shè)備復(fù)雜、耗費(fèi)和技術(shù)要求高二、植物組織培養(yǎng)的類型按材料的類別分：愈傷組織培養(yǎng)：最為常見的組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)：胚（Emb

3、ryo）、胚乳（Endosperm）、珠心（Nucellus）、子房（Ovary）、根、莖、葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng)原生培養(yǎng)（Protoplast ）1、愈傷組織：愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。幾個概念：外植體（Explants）由活植物體上切取下來的可以用于組織培養(yǎng)的組織或。初代培養(yǎng)（Primary culture）指外植體的最初培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)（Subculture）將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復(fù)多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。按培養(yǎng)過程分為： 初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)按培養(yǎng)方法分為： 固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（Nursing

4、culture）微室培養(yǎng)（microchamber culture ）包埋培養(yǎng)（embedding culture ）三、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史：組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展只是近 50但它的整個歷史可以追溯至 19 世紀(jì)末和上世紀(jì)初;20 世紀(jì)初，在 Schleiden 和Schwann 所發(fā)展起來的細(xì)胞學(xué)說的推動下，1902年德國植物學(xué)家 Haberlandt 提出了高等植物的成的觀點，以及植物細(xì)胞全能性的理論;即植物的體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷株的潛在能力。和組織為許多細(xì)胞組和繁殖，發(fā)育成完整植五個階段：探索階段（1902-1929 年）組培方法和定義的建立階段（1930-1939 年）

5、細(xì)胞全能性的證實階段（1940-1959）組培技術(shù)和理論迅速發(fā)展階段（1960-1979）組培技術(shù)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用階段（1980-今）1. 探索階段（1902-1929 年）Haberlandt：觀點：高等植物的組織和可以不斷分割直至分成單個細(xì)胞貢獻(xiàn)：并設(shè)想離體細(xì)胞具有再生完整植株的潛力提出細(xì)胞全能性首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)芝麻和鳳眼蘭的柵欄細(xì)胞和虎眼萬年青屬表皮細(xì)胞Knop+蔗糖？無細(xì)胞高度分化+培養(yǎng)基中無生長激素+培養(yǎng)基過于簡單我愿意觀察到細(xì)胞：在培養(yǎng)實驗中，雖然經(jīng)常觀察到細(xì)胞的明顯生長，但從未。發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)的條件，將是未來培養(yǎng)試驗的難題。在未來，人們可以成功地從營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)出人工胚。關(guān)于單

6、離植物細(xì)胞培養(yǎng)實驗其它研究：1904 年：Hanning 胚培養(yǎng)：培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的胚，得到植株1922 年：Kotte 和 Robbins 根培養(yǎng)1922 年：Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得蘭花幼苗，克服其1925 年：Laibach 亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種發(fā)芽。2. 組培方法和定義的建立階段（1930-1939 年）1934 年：White 番茄根建立第一個植物無性系。當(dāng)根 2 厘米長切成 0.5-1 厘米切斷，無菌液體培養(yǎng)完全 相同的離體根根離體培養(yǎng)真正成功。 提出植物細(xì)胞全能性假設(shè)。1934 年：Gautherete 培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了Callus 1937 年：

7、White 發(fā)現(xiàn) 3 種B 族維生素和IAA 對植物生長有用 1939 年：Gautherete 培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功1939 年：White 培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段成層成功1939 年：Nobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功3. 細(xì)胞全能性的證實階段（1940-1959）1943 年：White 植物組織培養(yǎng)手冊A Handbook of Plant Tie Culture標(biāo)志組織培養(yǎng)成為一門新興學(xué)科1946 年：菟絲子莖尖培養(yǎng)地觀察到花的形成為試管奠定了基礎(chǔ)1948 年：Skoog 和培養(yǎng)煙草莖段時發(fā)現(xiàn)腺嘌呤(adenine)或腺苷(adenosine)可解除生長素對芽生長

8、的抑制作用腺嘌呤/生長素高，生芽；低，生根；相等，不分化。1952-1953 年：胞能象科學(xué)家Steward F.C. 用胡蘿卜根的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)單個細(xì)卵(zygote)發(fā)育成胚一樣的途徑發(fā)育成完整植抹證實了植物細(xì)胞全能性學(xué)說。1952 年：Morel 和 Martin 首次植株。莖尖分生組織的離體培養(yǎng)獲得無大麗花1954 年：Muir（）將煙草愈傷組織置于固體培養(yǎng)基上在其上放一片濾紙(filterpr),再在濾紙片上放上一 個煙草體細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)成功。1956 年：Miller 分離出 Kinetin，Kinetin / 生長素4. 組培技術(shù)和理論迅速發(fā)展階段（1960-1979）1960

9、 年以來組織培養(yǎng)理論、實踐、技術(shù)和方法不斷完善和發(fā)展并形成獨(dú)具特色的專業(yè)技術(shù)組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的許多分支學(xué)科并取得豐碩的成果。4.1 原生培養(yǎng)1960 年：英國 Cocking 酶解法分離原生細(xì)胞一樣進(jìn)行細(xì)胞融合。獲得成功使植物細(xì)胞可以象動物1971 年，植株。takebe 和Nagata 首次利用煙草葉片分離原生并獲得再生我國獲得了 30 個以上品種的原生再生植株其中包括難度較大的重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高梁、大麥、棉花、油萊、馬鈴薯等。4.2 細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交1972 年，Carlson 誘導(dǎo)粉藍(lán)煙草和煙草的原生融合得到種間體細(xì)胞雜種第一株體細(xì)胞雜種

10、。1978 年，有性雜交不親和的番茄/馬鈴薯間的體細(xì)胞雜交獲得了雜種植株(Melchers)隨后獲得了地上結(jié)番茄，生馬鈴薯的雜種植物。1985 年，馬鈴薯的栽培品種與野生種的體細(xì)胞雜交得到了抗晚疫病和卷的體細(xì)胞雜種(Austinhybrid)。4.3 胚胎培養(yǎng)和試管避免 后胚乳(endosperm)發(fā)育不良(hypogenesis)或因種胚與胚乳間不親和而致使雜種胚夭折，及時分離幼胚接種在無激素培養(yǎng)基上使之直接成苗，這就是胚挽救。大大提高遠(yuǎn)緣雜交的成功率?？茖W(xué)家在裁培種菜豆、黃麻和花生的遠(yuǎn)緣雜交中獲得了理想的重組體。中國農(nóng)科院蔬菜所培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)(cabbage)和大白菜(chi胚得到了種間雜種

11、。4.4 組織及細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)近 50 年來飛速的發(fā)展cabbage)的雜種從 400 多種植物培養(yǎng)細(xì)胞中分離到 600 多種次級代謝產(chǎn)物(secondary metabolites )其中 60 多種在含量上超過或等于其原植物，20 種以上干重超過 1。在地黃細(xì)胞。，人參細(xì)胞培養(yǎng)已達(dá) 130600L 發(fā)酵罐德國，用 1000L 發(fā)酵罐培養(yǎng)毛(industrialization)在我國，人參細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也已實現(xiàn)限公司 。4.5 單倍體(haploid)育種珈儂生化有1964 年體植株。的 Guba 和 Meheshiwari 培養(yǎng)曼陀羅花藥獲得了第一棵單倍我國于 1970 年開始這方面的

12、研究，也取得了很大的成果。40 種以上植物獲得單倍體植株，其中小麥、玉米、橡膠樹、柑桔、甘蔗(sugar cane)、大豆、葡萄(gr、辣椒（capsicum）、油菜（r） 、)和蘋果等的單倍體植株為我國首創(chuàng)。通過單倍體育種獲得了水稻、小麥、煙草、辣椒和甜櫻新品種。中花 8 號、9號等 15 個水稻新品種，總種植面積達(dá) 1000 萬畝。通過花粉和花藥培養(yǎng)已獲得了幾百種植物的單倍體植株。5. 組織培養(yǎng)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用階段（1980 年-今）花藥培養(yǎng)：中花 8 號水稻、京花 1 號小麥。體細(xì)胞無性系變異：我國已經(jīng)培育出抗白及賴氨酸(lysine)、甲硫氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量高于親本系的

13、水稻變異體突變(muion)體誘導(dǎo)和篩選：細(xì)胞突變體的篩選最早始于 1959 年，G，Melchers 在獲得了溫度突變體草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中迄今為止，不少于 15 個科、45 個種的植物細(xì)胞培養(yǎng)中篩選出 100 個以上的細(xì)胞突變體或變異體，有抗病細(xì)胞突變體、逆境脅迫抗性突變體、抗除草劑細(xì)胞突變體及營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞突變體等。植物快速繁殖技術(shù)：60 年代，法國的Morel 用莖尖培養(yǎng)的方法大量繁殖蘭花獲得成功植物快速繁殖技術(shù)、試管苗工廠化生產(chǎn)和無種苗生產(chǎn)技術(shù)在 70 年代得到了快速的發(fā)展。、法國、意大利、荷蘭等歐并且以每年 7-8的速度增加。家試管苗的年產(chǎn)量均在數(shù)千萬株以上，種苗生產(chǎn)的研究始于 70

14、年代，到“七五”期間研究我國快速繁殖和無成果開始向應(yīng)用轉(zhuǎn)化并大見成效。馬鈴薯無毒種薯和甘蔗種苗已在生產(chǎn)上大面積種植。體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工1958 年，Reinert 在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最先發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎(胚狀體embryoid)水稻、小麥、玉米等 100 多種植物（43 科、92 屬）能通過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。1977 年，Murashige 第一次提出人工構(gòu)想把胚狀體包埋在膠囊(capsule)內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有接播種于田間。的機(jī)能并可直80 年代初，美、日、法等國相繼開展了人工的研究并且在胡蘿卜(carrot)、苜蓿(clover)、芹菜(celery)、花椰菜(cauliflo

15、wer)、萵苣(lettuce)、花旗松等植物上獲得了初步的成功。我國人工發(fā)展計劃”。的研究開始于“ 七五”期間，并且被列人了“863 高技術(shù)研究組織細(xì)胞培養(yǎng)物的超低溫保存及種質(zhì)庫的建立：植物細(xì)胞全能性的發(fā)現(xiàn)和證實，為植物的種質(zhì)資源(Germplasm Resource)的長期保存開辟了一條新途徑。許多植物的組織培養(yǎng)物在液氮中超低溫保存(Cryopreservation)以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性。如胡蘿卜和煙草的懸浮細(xì)胞超低溫保存 6 個月以后仍然能恢復(fù)生長并分化出植株。四、植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展研究材料范圍逐步擴(kuò)大：胚、胚軸(hypocotyl

16、)、子葉(cotyledon)、幼苗、莖尖、根、葉等；培養(yǎng)方法逐步完善： 固體培養(yǎng)發(fā)展到液體振蕩或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)、液滴培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、包埋(embed)培養(yǎng)培養(yǎng)基不斷改進(jìn)：White 培養(yǎng)基、MS 培養(yǎng)基、MT 培養(yǎng)基等實驗逐步完備：五、植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用快繁：人工、莖尖培養(yǎng)脫毒：微芽嫁接、莖尖培養(yǎng)克服雜交不親和：花藥培養(yǎng)、細(xì)胞融合種質(zhì)資源保存和交換：愈傷組織培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)倍性育種：花藥培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)突變體篩選：愈傷組織培養(yǎng)創(chuàng)造新種質(zhì)：細(xì)胞融合克服胚敗育：胚培養(yǎng)植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)第二章植物組織培養(yǎng)的設(shè)備與培養(yǎng)條件主要內(nèi)容：一、植物組織培養(yǎng)二、儀器和設(shè)備三、玻璃器皿和用具四、培

17、養(yǎng)條件設(shè)計2.1 植物組織培養(yǎng)組成、設(shè)計2.1.11、培養(yǎng)室培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)物。通常要有放置架、照明燈具、調(diào)溫設(shè)備。高級的培組成養(yǎng)室還要有調(diào)濕設(shè)備、自動控溫控濕儀器、能的緩沖室、循環(huán)風(fēng)通風(fēng)設(shè)備等。嚴(yán)格的培養(yǎng)室應(yīng)該是無菌的。特別是大型生產(chǎn)性組培車間，應(yīng)是無菌、無塵的。2、用于進(jìn)行試材（外植體）準(zhǔn)備和滅菌處理，培養(yǎng)基、滅菌和保存，各種用具及培養(yǎng)容器洗滌和滅菌、貯藏，培養(yǎng)基用藥品及其他試劑保存、蒸餾水和，各種儀器放置和使用等。如果可能的話，應(yīng)該與洗涮室、培養(yǎng)基室、器皿存放室、植物生長箱室、暗培養(yǎng)室等分別設(shè)置。2.1.2設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培

18、養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）、洗滌室（區(qū)）玻璃器皿和器皿、洗 、干包括用自來水、洗液、洗滌劑包括自然晾干和烘箱干燥、藥品室存放常用的化學(xué)試劑無機(jī)鹽類、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)劑等、室培養(yǎng)基的配制生理生化測定室（區(qū)）存放配制后的培養(yǎng)基或未用完的培養(yǎng)基、滅菌室即 、操作室室，是培養(yǎng)基、玻璃器皿、器皿和其他物品滅菌的地方也稱接種室，是開展組織培養(yǎng)研究包括接種、繼代、細(xì)胞融合等的場所。要求：干爽安靜，清潔明亮，墻壁光滑平整不易積污灰塵，地面平坦無縫便于 、培養(yǎng)室和滅菌。是將接種到培養(yǎng)瓶等年器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。主要設(shè)備：空調(diào)機(jī)、除濕機(jī)、換氣扇、培養(yǎng)架、燈光等8、馴化室植物組織培養(yǎng)材料移到田間前

19、，先移到馴化室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到田間苗圃。2.2 儀器和設(shè)備 、烘箱：陳列于洗滌室作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌測定培養(yǎng)物的干重氣浴、冰箱：陳列于室中作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。 、滅菌鍋：陳列于滅菌室中類型：普通醫(yī)用鍋大的高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種器皿的 、超凈工作臺：陳列于操作室（接種室）中類型：垂直式和水平式作用：無菌操作用5、顯微鏡：陳列于觀察室中類型：倒置顯微鏡普通顯微鏡熒光顯微鏡解剖顯微鏡6、天平：陳列于原生觀察和葉片氣孔觀察細(xì)胞觀察觀察室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑2.3 玻璃器皿及用具1、玻璃器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、

20、培養(yǎng)皿等顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等2、微孔過濾器（細(xì)胞過濾器）滅菌用：如激素一般用石棉濾膜3、細(xì)胞計數(shù)器統(tǒng)計培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目4、接種用具如鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等培養(yǎng)條件光照、溫度、濕度、氣體成分1、光照條件包括光照強(qiáng)度、時間長短、光照質(zhì)量等有的材料培養(yǎng)需要光，有的則不需光；不同的植物所需的光照強(qiáng)度也不一樣。一般 1000-5000Lx/12-16h/d2 、溫度條件大多數(shù)植物 23-32，一般 252 。低于 15 或高于 35 對植物的生長不利。3、濕度條件培養(yǎng)容器中濕度 100培養(yǎng)室的濕度一般 70 -80 的相對濕度。4、氣體5、培養(yǎng)基的滲透壓6、培養(yǎng)基的值商業(yè)化組

21、培設(shè)施設(shè)備：生產(chǎn)車間的設(shè)置和設(shè)備要求1.2.3.4.5.6.7.8.洗滌滅菌車間化學(xué)實驗車間接種車間培養(yǎng)車間倉庫冷藏室 煉苗室 移栽車間思考題1、一個正規(guī)的組織培養(yǎng)應(yīng)具備那些房間？2、組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？3、組織培養(yǎng)的環(huán)境條件有哪些？第三章培養(yǎng)基及其3.1 培養(yǎng)基的成分及其作用培養(yǎng)基（medium）是組織培養(yǎng)的重要材料，是外植體生長的營養(yǎng)基礎(chǔ)，只有配制出適宜培養(yǎng)基，才能使組織培養(yǎng)獲得成功。通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機(jī)成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是營養(yǎng)成分及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度。（一）礦質(zhì)營養(yǎng)礦質(zhì)營養(yǎng)又稱無機(jī)

22、營養(yǎng)，是指植物生長發(fā)育所需要的各種化學(xué)元素。礦質(zhì)元素的生理作用：（1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；（2）特殊物質(zhì)，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學(xué)作用；（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、的建成等。根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。國際植物生理學(xué)會建議將植物所需濃度大于 0.5 mmol/l 的的元素稱為大量元素。低于 0.5 mmol/l 的元素稱為微量元素。根據(jù)此規(guī)則大量元素種類包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中 C、 H、O 為氣體元素，其余六種為礦質(zhì)元素，分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為 18、10、 70、0.3%、0.07、0.

23、3%、0.3 、0.07%、0.05。微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl 等。1、大量元素（macro-elements）：組織培養(yǎng)中，各種礦質(zhì)營養(yǎng)主要從培養(yǎng)基中獲得，N、P、K、Ca、Mg、S等 6 種大量元素依靠各種無機(jī)鹽提供。不同植物種類和不同試驗?zāi)康膶υ氐氖褂昧恳蟛煌杞?jīng)試驗確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以 MS 應(yīng)用最廣泛。以 MS 為例 6 中礦質(zhì)元素分別由 KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2 . 2H2O 提供。大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮的形式被使用，但銨態(tài)氮濃度過高會對有些植物培

24、養(yǎng)物造成，不適宜使用過高的濃度。而常用 MS 培養(yǎng)基中既有硝態(tài)氮又有銨態(tài)氮。2、微量元素（micro-elements）：植物組織的對其需要量極少，過多會產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶系失活。代謝等。各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質(zhì)的及糖類的有關(guān)；銅能促進(jìn)離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。微量元素的用量較大，它對的起重要作用，由于在較高下，F(xiàn)eCl3 極易形成Fe（OH）3 沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨(dú)配制。（二）有機(jī)成分（anic comition）：主要包括各種維生素和氨基酸（Vitamin

25、and amino acid），如硫胺素（VB1）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、氨酸、酰氨、丙氨酸等。有時添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有 20 種氨基酸的混合物，用量 101000mg/L, 通常用于原生等培養(yǎng)。此外肌醇（myo-Inositol）是另外一種重要的有機(jī)成分，又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及維持離子平衡等生理作用。（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（regulating substan）：植物激素（Hormone）是植物新稱代謝中產(chǎn)生的天然

26、化合物，它能以極微的用量直接影響植物細(xì)胞分化、以及發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動。在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞體細(xì)胞胚胎發(fā)生等。、愈傷組織的生長、根芽的分化以及常用的植物激素及生長調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D2、細(xì)胞類：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素類：GA3、GA4、GA74、脫落酸：ABA5、乙烯：ETH1、生長素類：主要促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞，誘導(dǎo)形成愈傷組織，促進(jìn)生根。常用的有 NAA、IAA、IBA、2，4D

27、 等。2、細(xì)胞素類：促進(jìn)細(xì)胞萌發(fā)；延緩衰老。常用細(xì)胞和擴(kuò)大，促進(jìn)莖增促，抑制莖伸長；誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽素有 BA、KIN、ZT、2ip 等此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物(裂素活性，在多種植物上應(yīng)用。enyl urea derivatives)具有非常高的細(xì)胞分如TDZ(Thidiazuron 噻苯隆 )，CPPU (N-（2-氯-4-吡啶基）-N-苯基脲1-（2-chloro-4-pyridy）-3- 3、赤霉素類：enyl urea)等。主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對根無效；對形成層細(xì)胞分化有影響，與生長素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離體成花；打破休眠等功能。常用 GA3、GA4 等。4、脫落酸（ABA

28、）：促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于調(diào)節(jié)激素平衡，促進(jìn)形態(tài)建成。5、乙烯：主要促進(jìn)衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變化。（四）碳源(Carbon source)：碳源主要為細(xì)胞提供新化合物的骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源(Substrate and energy)，此外還能維持一定的滲透壓(Osmotic prere)。常用的碳源主要是蔗糖(Sucrose)，使用濃度在 25，此外果糖(Fructose)、葡萄糖(Glucose)、麥芽糖(Malt sugar)、山梨糖(Sor溶性淀粉(Soluble starch)等也常用于植物組織培養(yǎng)。e)、甘露糖(Mannose)及可糖濃

29、度高低直接影響形態(tài)建成(Mor（五）瓊脂(Agar)：ogenesis)。瓊脂作為劑(Curing agent)或支持物（Support）用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水（90 以上），成為凝膠，冷卻后（40 以下）即凝固為凝膠（Gel ）。瓊脂的用量通常在 410g/L.瓊脂是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中主要的成本支出，約占 80。瓊脂的凝固能力（Solidification capacity）除與原料、廠家的加工工藝有關(guān)外，還受高壓滅菌（High prere sterilization）時的溫度、時間以及otenz ofhydrogen ）影響。

30、（六）有機(jī)附加物（anic additives）： 1、椰子汁（Coconut milk）：用量為 100200g/L。2、香蕉泥（Mashed banana）：使用量為 150200g/L。3、蘋果汁（Apple juice）、番茄汁（Tomato juice）等。4、酵母提取物（Yeast extract）、麥芽浸出物（Malt extract）、水解酪蛋白（The hydrolysis of casein）（七）其他成分（Other ingredients）： 1、活性炭（Activated carbon）：使用量為 0.2-1%。 2、抗生素（Antibiotics）：常用青霉素（Pe

31、nicillin）、鏈霉素（Streptomycin）、慶大霉素（Gentamicin）等，用量在 520mg/L。3、抑制酚類物質(zhì)形成的物質(zhì)（Antioxidant）抗壞血酸（Ascorbic acid）：可以加入培養(yǎng)基或浸泡處理外植體。聚乙烯吡咯烷酮（PVP；Polyvinyl pyrrolidone）：加入培養(yǎng)基中。4、生長抑制劑（Growth inhibitor）常用矮壯素（CCC；chlorocholine chloride ；氯化 2-氯-N,N,N-乙銨）、比久（B9；N-二甲胺基琥珀酰胺；Succinic acid ）、多效唑（pp333；Paclobutrazol） 、三碘苯

32、甲酸（Three triiodobenzoic acid）、根皮酚（loroglucinol）等。3.2 培養(yǎng)基的類型及特點1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH 等。適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。2、中等鹽濃度培養(yǎng)基：Nitsh、Miller 等。大量元素濃度約為 MS 的 1/2。3、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White 等。大量元素濃度約為 MS 的 1/4 左右。適用于木本植物的培養(yǎng)。3.3 培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基母液及激素母液的配制：由于培養(yǎng)基中元素種類多，用量少，因此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營養(yǎng)成分配制成母液保存，配制培養(yǎng)基時根據(jù)需要量取用，從而簡化操作，節(jié)省時間。營養(yǎng)元素母液根

33、據(jù)其性質(zhì)和反應(yīng)特性混合。激素母液 根據(jù)使用濃度配制。1、器皿和用具（Utensils and applian）的準(zhǔn)備儀器包括萬分之一天平，百分之一天平，計用品包括不同型號的燒杯（Beaker），容量瓶（Volumetric flask）、移液管（Pipet）、試劑瓶（Reagent bottle）若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）滴管（Dropper）、玻璃棒（Glass rod）、試管（Test tube）、各種規(guī)格三角瓶（Triangle bottle）、培養(yǎng)基分裝器（Packaging machine），漏斗（Funnel）、稱量紙（Weighingpr

34、）、紙（Label）、不同范圍試紙、鉛筆等。玻璃器皿用前干凈。2、藥品及蒸餾水（Chemical and distilled water）準(zhǔn)備藥品采用分析純或化學(xué)純（ysis of pure or chemical pure）試劑。水利用蒸餾水或去離子水（Deionized water）。 3、母液配制：配制母液原則：相同類型的試劑混合； 易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認(rèn)真計算和核對；藥品要準(zhǔn)確稱量。MS 培養(yǎng)基母液的配制：MS 培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10 或20 倍）、微量元素母液（100 或 1000 倍）、Fe 鹽（100 倍）、有機(jī)物（1

35、00 倍）。配置前先進(jìn)行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機(jī)物用萬分之一天平稱量。（3）激素母液的配制：根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液，用萬分之一天平稱取激素，溶劑溶解后加水定容。生長素類、赤霉素類及脫落酸等用 95乙醇溶解；細(xì)胞或 1N NaOH 溶解。素類用 1N HCl通常激素母液濃度生長素類為 0.10.5 0.21.0 mg/ml.（二）培養(yǎng)基的配制：1、量取母液：營養(yǎng)元素和激素。mg/ml, 細(xì)胞素母液濃度為2、稱量蔗糖、瓊脂，放入 600ml 左右蒸餾水的鍋內(nèi)，電加熱，使瓊脂溶化。3、加入母液，混

36、合均勻，調(diào)整4、分裝入瓶，每瓶 4050ml。值。5、：用 46 層稱量紙，之后滅菌備用。（三）培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌 High pre 1、加熱：resterilization）：滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足，然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi)，改好蓋，關(guān)閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。2、排氣（Exhausting）：當(dāng)溫度升至 0.5kg/cm2 時，打開放氣閥徹底排出鍋內(nèi)冷空氣。然后關(guān)閉放氣閥，促使壓力繼續(xù)上升。3、溫度控制：當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至 1.1kg/cm2 時，計時 1520 分鐘，計時結(jié)束后，關(guān)閉電源。4、出鍋：當(dāng)滅菌鍋自然冷卻后，取出培養(yǎng)基，放置于接種室（Vaccination Ro

37、om）備用。（四）培養(yǎng)基的保存：1、防塵：防治灰塵污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒溫：4 oC 可保存 36 周，室溫下兩周內(nèi)用完。4。定期更新：不易長期保存。第四章植物材料4.14.24.3植物材料的特點 植物材料的選擇、無菌材料的獲得一、植物材料的特點植物組織培養(yǎng)是在無菌的條件下培養(yǎng)植物離體材料，這些用于無菌培養(yǎng)的離體植物材料稱為外植體（Explant）。外植體泛指第一次接種所用的植物組織、等一切材料，包括頂芽、腋芽、莖段、莖尖、形成層、皮層、花序、花瓣、胚珠、葉片、葉柄、花粉、根、表皮組織、胚、胚軸、子葉、胚根、塊莖、原生等。在植物組織培養(yǎng)中，選擇合適的植物材料是進(jìn)

38、行組織培養(yǎng)關(guān)鍵的一步。由于用于培養(yǎng)的材料和培養(yǎng)的目的是多種多樣的，因此，所采用的操作方法不一。4.1 外植體種類1帶芽外植體包括莖尖、頂芽、腋芽、根莖連接處的萌蘗等。適合植物的離體快速繁殖。2胚指自然狀態(tài)和試管中精卵融合后形成的各個時期的胚。帶有極其的分生組織細(xì)胞，它們是經(jīng)過有性過程所帶來的完全復(fù)壯，極其容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。3分化的組織包括嫩莖、嫩葉、形成層、根、花瓣、花萼以及珠心等二倍體組織可誘導(dǎo)到脫分化狀態(tài)，或直接形成不定芽/體細(xì)胞胚胎4花粉及雌配子體中的單倍體細(xì)胞這些細(xì)胞體內(nèi)只有體細(xì)胞中一半，它們是經(jīng)過減數(shù)后完全復(fù)壯的細(xì)胞4.2 植物材料的選擇、盡管所有的植物細(xì)胞都具有“全能性”，但不是任

39、何細(xì)胞都同樣能來的。要選擇那些在培養(yǎng)時，易起反應(yīng)，容易進(jìn)行再分化產(chǎn)生植株的部位作試驗材料。在同一植物的各個不同部位的組織、季節(jié)及生理狀態(tài)而有很大不同。中，其形態(tài)發(fā)生的能力，可因植株的植物的種質(zhì)（種類及品種或類型）選擇應(yīng)考慮選擇具有良好表型的植物，如抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量高等植株，為育種選擇的外植體應(yīng)選擇表型最優(yōu)的材料。選易于離體培養(yǎng)的種類、品種或類型；選生產(chǎn)上或研究上意義比較大的種類、品種或類型；考慮褐化問題外植體的增殖能力外植體必須有良好的增殖能力，并且應(yīng)在培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選增殖能力最強(qiáng)的材料；同時需要考慮通過試驗篩選繁殖不同3外植體的大小型植物所需要的特殊培養(yǎng)基。培養(yǎng)效果是一個外植體細(xì)胞

40、總體對各種培養(yǎng)因子的綜合反應(yīng)，外植體表面積、體積、細(xì)胞數(shù)量等都會影響培養(yǎng)效果。一般外植體大小可以在 0.51cm。在以植物的脫毒為培養(yǎng)目的時，一般要選用較小的外植體，應(yīng)在 0.20.5cm。僅誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，材料大小并無嚴(yán)格限制，只要將莖的切斷、葉、根、花、果或等的組織切成片或塊接種于培養(yǎng)基上就可以了。莖尖、胚、胚乳等培養(yǎng)，則按或組織切離即可。4外植體的和著生部位幼化程度。和植物的和著生部位關(guān)系密切。一般幼年植物的外植體要比成年樹的外植體容易培養(yǎng)，應(yīng)考慮從成年植株的下部幼年期的部位取材。部位效應(yīng)。不僅適年樹，同時也適用幼年樹，即同株植物體中，一般較低部位的外植體要比上部的外植體容易啟動，

41、培養(yǎng)成功可能性大。外植體可分為帶芽的外植體和由分化組織的外植體兩大類：前者如莖尖、側(cè)芽、原球莖、鱗芽等，可直接產(chǎn)生植株后者如莖段、葉、根等營養(yǎng)及花莖、花瓣、花萼、胚珠、果實、花藥等官，多由已分化的細(xì)胞組成。多數(shù)需要經(jīng)過脫分化和再分化過程，形成植株。5取外植體的季節(jié)和時間 對培養(yǎng)材料的啟動和培養(yǎng)得尤為突出。特別是進(jìn)行離體培養(yǎng)快速繁殖時，更顯處于生長的外植體培養(yǎng)容易春夏季取材滅菌容易6考慮木本材料的特殊性秋冬季取材難以成活 雨季濕熱季節(jié)取材不容易成功。純系比較難于獲得，導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)上和重復(fù)結(jié)果；效應(yīng)比較明顯，材料難于培養(yǎng)。野生大樹取材，滅菌難，增生難；不同取樣期結(jié)果大不一樣；位置效應(yīng)比較明顯，不同取

42、樣部位，培養(yǎng)結(jié)果大不一樣；經(jīng)常需要進(jìn)行幼化處理；多年田間生長原因，雜菌嚴(yán)重；木本植物材料經(jīng)常出現(xiàn)深休眠導(dǎo)致另外，應(yīng)該：首先選擇已有的無菌植物材料其次考慮優(yōu)先選用溫室植物，需要預(yù)先解除休眠。實在必要時，才從野外生長植株上取材選擇健壯植株細(xì)胞培養(yǎng)材料的選擇體胚發(fā)生用細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)用重視外植體放置方法無菌材料的獲得建立無菌外植體，獲得無菌培養(yǎng)材料是組培成敗第一步。防治外植體帶菌的措施（1）外植體預(yù)先培養(yǎng)室內(nèi)（如溫室）或無菌條件下對枝條進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)。一般采取，先將外植體用清水洗干凈，水培使其抽枝，然后以新抽的枝條作為外植體無菌的條件下暗培養(yǎng)，待有枝條長出后，取其作為外植體，經(jīng)常規(guī)體表滅菌，可以明

43、顯地減少培養(yǎng)過程中的污染（2）避免陰雨天在田間采取外植體晴天下午（3）外植體取材料的要比在早晨污染少有污染的材料組織（一般是的分生組織）4.3.2 外植體的滅菌的一個基本原則，應(yīng)該是既要把材料上附著的微生物殺死，同時又不傷及材料。各種材料的特點：殺菌劑的特點與效應(yīng)1.各種材料的特點：（1）莖尖、莖段以及葉片等材料的滅菌這些外植體體表攜帶有很多的微生物需要先在流水中沖洗，或使用洗滌劑、吐溫等進(jìn)行洗滌。表面滅菌時，要用 70乙醇浸泡數(shù)秒鐘，再用無菌水沖洗 2-3 次；然后依材料的程度，選擇適當(dāng)?shù)臏缇幤罚ㄈ?0.1%升）進(jìn)一步進(jìn)行體表滅菌。用無菌水洗滌干凈后，備用。（2）果實和的滅菌根據(jù)果實和的清

44、潔程度，用自來水沖洗 10-20 分鐘。再用 70乙醇體表滅菌 10-30sec。用無菌水洗滌 2-3 次后，就可以取出果實內(nèi)的養(yǎng)?；蚪M織進(jìn)行培如果污染嚴(yán)重，可以使用升或溴水進(jìn)行（3）花藥滅菌多采用未成熟花藥作為外植體的體表滅菌，效果良好。花藥成熟前，一般花藥的外面多花瓣、花萼或潁片，位于為成熟花藥的無菌狀態(tài)。所以只要將整個花蕾或幼穗進(jìn)行表面滅菌即可。用 70乙醇浸泡數(shù)秒，無菌水洗滌 2-3 次，然后在漂白粉溶液浸泡 10 分鐘，無菌水洗滌 2-3 次（4）根和生長在的滅菌的根或會攜帶大量的微生物，表面滅菌。先用流水沖洗干凈，用軟毛筆刷洗，水紙吸干后，再用乙醇漂洗。片切去損傷及污染嚴(yán)重的部位，

45、吸之后用 0.1-0.2%的升浸泡 5-10 分鐘，或用 2次氯酸鈉溶液浸泡 10-15 分鐘，無菌水沖洗凈殘留在體表的升或次氯酸鈉。不理想時，可以采用抽氣減壓的辦法，使得滅菌液進(jìn)入組織滅菌的目的。2.殺菌劑的特點與效應(yīng)，達(dá)到徹底次氯酸鈉溶液，它能分解出有殺菌效能的氯氣，以后散失到空氣中而對植物組織無害。過氧化氫，也易分解成無害的化合物而散失掉。低濃度的氯化（升）溶液，是一種令人滿意的后的離子在植物材料上不易去掉劑，但缺點是對于有些帶毛的材料，先用 70漂洗數(shù)秒鐘至更長一點時間。70酒精比其它濃度有更強(qiáng)的穿適力和殺菌力。但應(yīng)嚴(yán)格掌握好時間。劑濃度%去除難易時間（分）效果次氯酸鈣9-10易5-3

46、0很好次氯酸鈉2易5-30很好漂白粉飽和溶液易5-30很好溴水1-2易2-10很好過氧化氫10-12最易5-15好升0.1-1較難2-10最好70-75易0.2-2好抗菌素4-5(mg/L)中30-60較好硝酸根1難5-30好3、污染防除的其他注意事項環(huán)境的操作者無菌控制材料處理過程無菌控制4、滅菌的一般程序第五章植物離體快速繁殖5.1植物離體快速繁殖的意義與作用概念：離體繁殖、微型繁殖（微繁）快速無性繁殖（無性快繁）植物離體快速繁殖是應(yīng)用植物細(xì)胞的“全能性”理論，在無菌條件下，把離體的植物、組織，放在人工控制的環(huán)境中，使其分化、繁殖，在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量遺傳性一致的完整新植株的技術(shù)實質(zhì)：用植物

47、組織培養(yǎng)進(jìn)行營養(yǎng)繁殖是常規(guī)營養(yǎng)擴(kuò)展和延伸離體繁殖的意義：最主要的是替代傳統(tǒng)的營養(yǎng)繁殖方法以增加繁殖系數(shù)繁殖系數(shù)高，繁殖周期短，繁殖速度快繁殖材料用量少，占用空間小，不受季節(jié)限制，可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)300m210000 瓶數(shù)萬株苗(3)(4)(5)(6)(7)便于種質(zhì)資源的與交換，應(yīng)用廣泛，是推廣良種的重要能獲得無毒苗木無性系保持母本特性木本植物應(yīng)用潛力大離體繁殖誘變離體繁殖的途徑:1、直接增生不經(jīng)過脫分化階段，直接再分化或分蘗2、通過愈傷組織增生 經(jīng)過脫分化和再分化3、通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生先誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，再由胚狀體發(fā)育成胚至完整植株幾個相關(guān)概念外植體繼代培養(yǎng)(Subculture)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)（Tr

48、ansfer）莖叢或不定芽（Shoots 或 Microshoots）微枝（Microcuttings）小植株（Plantlets） 試管內(nèi)（In Vitro）試管外（Ex Vitro）5.2植物離體快速繁殖的基本程序1、無菌培養(yǎng)物的建立2、莖叢的增殖3、莖叢生根4、植株移栽馴化5、商品苗栽培1、無菌培養(yǎng)物的建立本階段的目標(biāo)：成功地?zé)o污染地接種提供一個試管環(huán)境使培養(yǎng)物生長穩(wěn)定包括環(huán)節(jié)：外植體選擇外植體滅菌培養(yǎng)基選擇激素等添加物篩選穩(wěn)定培養(yǎng)外植體選擇(1)頂芽、腋芽試管萌發(fā)增殖途徑材料準(zhǔn)備選擇無病蟲害生長旺盛的材料，如下圖所示。野外材料注意事項清潔1-2 個月的枝冬芽芽鱗完全外植體準(zhǔn)備：外植體并

49、非將芽完全摘除培養(yǎng)，而是帶一段莖段，便于養(yǎng)分水分激素等的利用。有鱗片的冬芽，一般只取芽進(jìn)行培養(yǎng)（防污染）(2)不定芽直接增生途徑從組織誘導(dǎo)成芽-不定芽是從組織直接誘導(dǎo)成芽，不經(jīng)愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)材料：子葉、胚軸、葉、葉柄、幼葉莖軸、剝皮枝條穩(wěn)定培養(yǎng)系建立：2、培養(yǎng)材料的增殖本階段的目標(biāo)：維持培養(yǎng)物的穩(wěn)定狀態(tài)基本培養(yǎng)基：基本同第一階段的培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：不斷增殖莖叢達(dá)到需要數(shù)量也可通過實驗選擇系列培養(yǎng)基細(xì)胞素為主生長素為輔階段不同，需要不同根據(jù)需要不斷調(diào)整莖叢發(fā)生發(fā)生率（增生率）增生培養(yǎng)基及其附加物莖叢擴(kuò)繁擴(kuò)繁系數(shù)擴(kuò)繁培養(yǎng)基及其附加物增殖體大小與繼代培養(yǎng)間隔培養(yǎng)的光照與溫度注意事項：變異

50、，玻璃苗、褐化、染菌3、生根階段功能：組培微枝生根從試管內(nèi)無菌環(huán)境轉(zhuǎn)移到試管外有菌環(huán)境生根方式：試管內(nèi)生根試管外生根試管內(nèi)生根基本培養(yǎng)基：常減半生長調(diào)節(jié)劑：不用素、少用生長素其它附加物：活性炭、間苯三酚、瓊脂溫度略低于增殖試管外生根馴化過程：洗凈根部馴化基質(zhì)溫度調(diào)控土壤濕度空氣濕度光照強(qiáng)度與我國及國不同商業(yè)化生產(chǎn)的組培莖從不在試管內(nèi)進(jìn)行生根培養(yǎng)，而是直接在試管行生根：1、同時進(jìn)行煉苗、增壯、移栽和苗木培育，苗木生根和生長效果都非常好2、而且減少了許多工序，降低了成本（可達(dá) 70%）。試管外生根 2 種方案：第 1 種方案：將微枝速蘸上生長素（IBA）情況下溫室內(nèi)人工基質(zhì)上生根第 2 種方案：在

51、含生長素的瓊脂培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基上處理微枝 5-10 天之后沖洗掉瓊脂，栽植于試管外環(huán)境試管內(nèi)、外生根差異：試管外根系更“正常”，表現(xiàn)在：腫脹表皮細(xì)胞少維管系統(tǒng)更好減去管外適應(yīng)過程試管內(nèi)生根好處適合于難生根植物加快微枝成熟進(jìn)程 15 年開花-1-2 年4、馴化（Acclimatization）包括兩個過程：異養(yǎng)（供糖）階段過渡到自養(yǎng)階段人工環(huán)境過渡到野外自然環(huán)境注意事項：小植株旺盛生命力的保持環(huán)境到正常野外環(huán)境的逐漸過渡差異：試管苗葉無蠟層、無致密表皮層試管苗氣孔馴化的強(qiáng)化： 1、移栽前細(xì)胞常突出表皮、氣孔長開把試管內(nèi)濕度降低到較低程度（35%）如加入去濕劑、降低培養(yǎng)器皿溫度增加培養(yǎng)基滲透壓（

52、加糖）、用激素進(jìn)行前處理2、移栽后逐漸降低濕度（間歇噴霧、薄膜覆蓋）5、商品苗培育1、直接育苗，如紫葉白樺、歐洲丁香2、建采穗圃，如桉樹3、建微型園，如松樹5.3植物離體快速繁殖的影響外植體（內(nèi)因）：1.外植體的型2.外植體的類型及其生理狀態(tài)（1）外植體的類型（2）取材植株的3.繼代培養(yǎng)次數(shù)及生理狀況4.愈傷組織的遺傳特性及其生理狀態(tài)芽的增殖途徑：1、嫩梢扦插增殖途徑2、叢生芽增殖途徑3、發(fā)生途徑4、胚狀體途徑5、原球莖途徑繼代培養(yǎng)無性系 620014無性系 800057平均每瓶莖數(shù)平均每瓶根數(shù)平 均 每瓶莖數(shù)平均每瓶根數(shù)第一次111268第二次17181011第三次42411515第四次29

53、301212第五次242269植物種第一時期第二時期第三時期第四時期：商品用 1020%漂白液洗滌 5cm 莖尖，去用 Anderson 培1/2MS 加 2-7生根后逐漸 化微繁應(yīng)用除葉和頂芽。用 70% 浸泡 10s，養(yǎng)基加 2ip，單mg/L 的IBA 和降低濕度馴 廣泛的觀賞沖洗，用 10%漂白液浸 20min，沖洗個莖芽繼代培活性炭，試管內(nèi)化木本植物的3 次。養(yǎng)生根。代表 剪掉下部 1cm 保留 24cm，平置于斜或用草炭:珍珠面瓊脂培養(yǎng)基上。巖= 1:1 的基 用 Anderson 培養(yǎng)基加 2ip 5 mg/L、質(zhì)，經(jīng) IBA 處IAA0.1 mg/L 和腺嘌呤 80mg/L，每

54、 2理后，試管外生周轉(zhuǎn)接一次，有生長后每 5 周轉(zhuǎn)接 1根次。莖芽充分發(fā)育后才能進(jìn)行繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基（外因）基本培養(yǎng)基碳源氮源含氮量存在很大差異硝酸鹽和銨鹽的比例 4.激素其它因子培養(yǎng)基的物理性質(zhì)如物種類、滲透壓及也有明顯地影響培養(yǎng)條件（外因）光照條件：光強(qiáng)、光質(zhì)、光周期培養(yǎng)溫度幾種植物種類的最適培養(yǎng)溫度值等對體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生及發(fā)育種類溫 文竹百合適溫種類適溫種類適溫 種類適17大蒜茄子白菜菊芋22262530蘋果 柑橘 刺槐 毛白楊26 水稻282025262025252820252627242727小麥大麥玉米月季培養(yǎng)容器內(nèi)氣體成分溶解態(tài)氧的含量 、乙烯等濕度條件周圍環(huán)境較適宜的相對濕度為 7

55、0%80%其他問題1 .2 .污染培養(yǎng)基的褐變：間隔幾天轉(zhuǎn)換新鮮的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)與半固體培養(yǎng)結(jié)合；利用抗氧化物如半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸等初始階段避光栽培試管苗的玻璃化 試管苗的移栽成活遺傳穩(wěn)定性3 .4 .5 .光自養(yǎng)微繁：植物無糖組織培養(yǎng)(Sugar-freemicropropagation)又稱為光自養(yǎng)微繁殖(otoautotroic micropropagation)是指容器中的小植株在人工光照下，吸收 CO2 進(jìn)行光合作用，以完全自養(yǎng)的方式進(jìn)行生長繁殖。特點：CO2 代替了糖作為植物體的碳源不形成糖(例如蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨糖等）無糖組培（碳源）CO2轉(zhuǎn)化成閉鎖型培養(yǎng)室特點優(yōu)

56、勢和限制優(yōu)勢和限制1、控制不當(dāng)造成大面積2、干旱脅迫現(xiàn)象3、養(yǎng)分虧缺情況4、組培環(huán)境要求較高5、培養(yǎng)的植物材料受到限制適用范圍無糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)適用于所有的植物，包括木本植物、草本植物、藤本植物，C3 植物、C4 植物和CAM 植物（例如菠蘿）。只有植物具備光合能力，即有一定的葉面積含有一定的時，才能進(jìn)行無糖培養(yǎng)。換句話說，無糖培養(yǎng)只能用于繼代增殖階段和生根成苗階段，預(yù)備階段不能采用無糖培養(yǎng)的方法，因為此時植株還沒有形成一定的葉面積，尚不具備光合作用的能力。第 6 章 植物愈傷組織培養(yǎng)6.16.26.3植物愈傷組織及形成過程植物愈傷組織與遺傳變異愈傷組織培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織（ca

57、llus）是指由外植體組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定形的疏松排列的薄壁組織。隨著培養(yǎng)時間的增長，這種組織會出現(xiàn)分生組織區(qū)、管胞和色素細(xì)胞，或者形成體細(xì)胞胚。一般情況下，植物組織都能誘發(fā)形成愈傷組織能形成體細(xì)胞胚的愈傷組織叫胚性愈傷組織。（embryonic callus）。誘導(dǎo)和培養(yǎng)愈傷組織具有多種用途:可研究植物生長發(fā)育及分化的機(jī)制、遺傳變異規(guī)律；可用于大規(guī)模生產(chǎn)有用化合物；用于細(xì)胞培養(yǎng)篩選工業(yè)、上有用的無性系；（4）用于原生培養(yǎng)中的原生來源等。一、植物愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)大多數(shù)愈傷組織都是具有疏松結(jié)構(gòu)的柔軟組織，它們是由許許多多小型細(xì)胞聚合而成的。愈傷組織的顏色極不一致，并且常常是變化著的。優(yōu)

58、良的愈傷組織通常必須具備以下 4 個特性：高度的胚性或再分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植株。容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性原生。旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，以便有可能對它們進(jìn)行各種遺傳操作。二、植物愈傷組織的形成過程從單個細(xì)胞或外植體上形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷 3 個時期起動期期 形成期分化期（）起動期（誘導(dǎo)期，induction stage ）：指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行的時期。接種植物材料的成熟細(xì)胞在一些刺激動加強(qiáng)，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)的和激素的誘導(dǎo)作用下代謝活，但此時細(xì)

59、胞的大小變化不大。組織的機(jī)械損傷也作為一種刺激現(xiàn)在傷口處；誘導(dǎo)細(xì)胞開始，故愈傷組織往往出外源生長物質(zhì)也是一種誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)細(xì)胞開始，通過調(diào)整它的種類和濃度來誘導(dǎo)細(xì)胞開始的。(2)期：期是指細(xì)胞通過一分為二的方式，不斷增生子細(xì)胞的過程。期的愈傷組織的共同特征是：細(xì)胞快、結(jié)構(gòu)疏松；缺少組織結(jié)構(gòu)、顏色淺而透明。（3）形成期：形成期（formation stage）是指外植體的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、的愈傷組織的時期。愈傷組織內(nèi)細(xì)胞的特點是：形成了無序結(jié)構(gòu)大而不規(guī)則、高度液泡化。沒有次生細(xì)胞壁和胞間連絲，整個組織是比較松散的；表面以下約 5-10 個細(xì)胞是細(xì)胞生長的中心，分生中心的細(xì)胞明顯小些，出現(xiàn)了胞間連絲和果

60、膠質(zhì)，這些中心是愈傷組織的主要生長部位。不同外植體來源的愈傷組織有一定的均一性。誘導(dǎo)條件不同，愈傷組織的形態(tài)和物理性質(zhì)也有一定的變化，有的緊密堅實，有的疏松脆弱。（4）分化期（differentiation stage）：停止愈傷組織。的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化而形成由不同形態(tài)和功能的細(xì)胞組成的(1)愈傷組織表層細(xì)胞的處的局部地區(qū)的細(xì)胞開始逐漸減慢，直至停止；進(jìn)而轉(zhuǎn)向愈傷組織深，出現(xiàn)了瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和分化。(2)分生組織瘤狀結(jié)構(gòu)和維管組織的形成 (3)細(xì)胞的體積不再減小：(4)出現(xiàn)各種類型的細(xì)胞 (5)出現(xiàn)一定的形態(tài)特征：生長旺盛的愈傷組織一般呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的，老化的愈傷