環(huán)氧化物水解酶

1、微生物環(huán)氧化物水解酶引言環(huán)氧化物水解酶廣泛分布于動物界(包括人類)，在肝臟中，環(huán)氧化物水 解酶主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)上，最近的研究表明，它也分布于肝細(xì)胞的核膜、 胞漿中，而在環(huán)氧化物酶體、溶酶體和線粒體中缺失。環(huán)氧化物水解酶以多種同工酶形式存在，酶的單體相對分子量為 48k-54k之間，沒有血紅蛋白和黃素做輔基。環(huán)氧化物水解酶也可催化內(nèi)源性和外源性的環(huán)氧化物，其中對內(nèi)源性 環(huán)氧化物的速率遠(yuǎn)大于外源性的環(huán)氧化物。因為環(huán)氧化物水解酶在致癌物 的形成中扮演一定角色，所以被作為肝癌的早期標(biāo)志二受到廣泛關(guān)注！環(huán)氧化物(epoxide )在多種生物體的代謝過程中廣泛存在，又在多種生物活性物質(zhì)的合成 中被廣泛應(yīng)

2、用，它們是一類很有價值的手性有機(jī)合成砌塊和中間體。環(huán)氧化物具有環(huán)氧乙烷 三元環(huán)，該環(huán)中各原子的軌道由于不能在正面充分重疊，而是以彎曲鍵連接，因而具有較強(qiáng) 的張力，其碳氧鍵具有很強(qiáng)的親電性，故其能與各種親核試劑反應(yīng)，通過選擇性開環(huán)及官能 團(tuán)轉(zhuǎn)換，就可以很方便地合成很多種光學(xué)活性物質(zhì)，而且它們的反應(yīng)活性高，其開環(huán)反應(yīng)中 通常具有極好的位置選擇性和立體選擇性。環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase)又稱環(huán)氧化物水合酶(epoxide hydratase)或環(huán)氧化物水化 酶(epoxide hydrolase)，能立體選擇性地將水分子加到環(huán)氧底物上生成相應(yīng)的手性1,2-二醇。 應(yīng)用此酶，能

3、夠得到具有光學(xué)活性的剩余環(huán)氧化物和相應(yīng)的二醇化合物。該酶在生物體內(nèi)的 外源性化合物代謝中起著重要的作用。因此，環(huán)氧化物水解酶在生物體內(nèi)，尤其是微生物體 內(nèi)，是普遍存在的。一、選育對細(xì)菌EH的研究最早是在1967年，Schroepfer等人在Pseudomonad(NRRL.2994)中發(fā)現(xiàn) 7EH，并利用該酶成功催化水解了環(huán)氧油酸。此后奧地利的K.Fabe究小組開辟了對微生 物環(huán)氧化物的研究。細(xì)菌環(huán)氧化物水解酶在自然界中普遍存在，分組成型和誘導(dǎo)型兩大類。前者的底物適用 性較廣，可以很高的對映體選擇性水解各種2取代的環(huán)氧化物，例如：1,1-二取代，2,2-二取 代和2,3-二取代，但其比活力都不

4、高，但是對于無分支的末端l,2-環(huán)氧化物的選擇性較低，且 對于內(nèi)消旋環(huán)氧化物的活性較低。后者的底物域相對較窄，是和誘導(dǎo)物結(jié)構(gòu)相似的環(huán)氧化物， 比活力較高。對用真菌環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行環(huán)氧化物的不對稱水解反應(yīng)的研究開始得更早。始于1972年日 本Suzuk i等人用Helminthospsrum sativwn對一種萜類環(huán)氧化物10,11-環(huán)氧法呢醇進(jìn)行對映體 選擇性開環(huán)。但是對其真正的研究是在1993年由法國的Furstoss等展開的。真菌環(huán)氧化物水 解酶一般是組成型酶，一般可以用廉價的普通碳源進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)。其底物范圍相對較 廣，對取代脂環(huán)族、芳香族和無分支的脂肪族末端l,2-環(huán)氧化物具有

5、特別高的立體選擇性。 其中真菌中的酵母細(xì)胞由于培養(yǎng)簡便且易于從發(fā)酵液中分離，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，具 有良好的應(yīng)用潛力。研究發(fā)現(xiàn)，許多絲狀真菌的環(huán)氧化物水解酶是組成型酶，其底物范圍廣， 對映體選擇性高，尤其是對含有芳香基團(tuán)、取代脂環(huán)基的環(huán)氧化物的選擇性很高，是一種非 常具有潛力的工業(yè)用生物催化劑。二、酶學(xué)特性理化特性溫度目前的環(huán)氧水解酶基本都是常溫酶。通常情況下酶在室溫下是比較穩(wěn)定的，反 應(yīng)溫度較低時，適當(dāng)提高溫度，會加速反應(yīng)的進(jìn)行，但繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，會導(dǎo)致酶的失活 加劇，并極大地降低酶的對映選擇性。但也有某些酶，對溫度比較敏感，在這種情況下，可 選擇較低的溫度，如在4C進(jìn)行酶催化水解反應(yīng)

6、。pH環(huán)氧化物比較活潑，在酸性條件下容易自發(fā)水解，這種化學(xué)水解是非選擇性的， 它將極大地降低酶催化水解產(chǎn)物的對映選擇性(ee值)，這極大地限制了環(huán)氧水解酶催化反應(yīng) 的pH范圍。此外，過酸性或過堿性的環(huán)境也容易引起酶的失活，故環(huán)氧水解酶催化的反應(yīng)， 通常都是在中性或偏堿性條件下進(jìn)行。助溶劑大部分環(huán)氧化物的水溶性很差，添加水互溶性的有機(jī)助溶劑可部分地解決這 個問題，增強(qiáng)底物的水溶性，消除傳質(zhì)的限制，加速反應(yīng)的進(jìn)行。但助溶劑的添加也會造成 酶的失活，且隨著助溶劑濃度的提高，其失活效應(yīng)加強(qiáng)。助溶劑對反應(yīng)的影響是上述兩個效 應(yīng)共同作用、平衡的結(jié)果。表面活性劑表面活性劑同樣可以提高水不溶性物質(zhì)在水中的分散

7、度。陰離子表面活 性劑會降低酶的活性，同時降低其選擇性;兩性離子表面活性劑對酶活和選擇性有輕微的促 進(jìn)效應(yīng);而部分非離子型表面活性劑對酶活和對映選擇性有顯著的提升作用，尤其是當(dāng)表面 活性劑的濃度遠(yuǎn)高于臨界膠束濃度時，在一定濃度范圍內(nèi)，其對酶活和對映選擇性的提升效 果隨表面活性劑濃度的升高而提高。此外陽離子表面活性劑對酶有較強(qiáng)的負(fù)面影響。底物濃度當(dāng)酶催化劑/底物一定時，通常隨著底物濃度的升高，酶的對映選擇性提高， 可用界面激活效應(yīng)進(jìn)行解釋。當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r，通常隨著催化劑濃度的提高，反應(yīng)選擇性 上升。催化特性對映體選擇性(Enantioselectivity)對映體選擇性指環(huán)氧水解酶可以選擇性地

8、水解底物的某種構(gòu)型，所篩選的各種酶中，微 生物來源的酶普遍優(yōu)先水解R-構(gòu)型的環(huán)氧化合物，留下S-構(gòu)型底物，而來源于人體以及幾種 植物的環(huán)氧水解酶則優(yōu)先水解S-構(gòu)型環(huán)氧化物。區(qū)域選擇性(Regioselectivity)對于大多數(shù)酷的動力學(xué)拆分來說，在反應(yīng)過程中對映體中心的絕對構(gòu)型總是保持不變。 但環(huán)氧水解酶催化的反應(yīng)與此不同，環(huán)氧化物的酶水解可能通過對環(huán)氧乙烷的任一個碳進(jìn)行 攻擊而發(fā)生，當(dāng)親核攻擊發(fā)生在非取代的碳原子上，產(chǎn)物的絕對構(gòu)型保持不變與次相反， 當(dāng)親核攻擊發(fā)生在取代的碳原子上，產(chǎn)物的絕對構(gòu)型發(fā)生反轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象也稱之為構(gòu)型逆轉(zhuǎn)。對映會聚(Enantio convergent)和 選擇性互

9、補(Selectivity complementary)對映會聚現(xiàn)象是指使消旋的混合物變成單一的對映體的現(xiàn)象。選擇性互補是指兩種酶催 化同種環(huán)氧化物時，一種優(yōu)先選擇R-構(gòu)型，而另一種優(yōu)先選擇S-構(gòu)型，則這兩種酶是選擇 性互補酶用兩種選擇性互補的環(huán)氧化合物水解酶共同催化環(huán)氧化合物的水解，可以實現(xiàn)對映 會聚。三、催化機(jī)制要研究EH催化環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)的作用機(jī)制，就應(yīng)先對EH的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。現(xiàn)在 已經(jīng)有90多種環(huán)氧化物水解酶被分離純化和測序，其中一半以上被確定是蛋白質(zhì)。從前面的 研究結(jié)果分析判斷，EH結(jié)構(gòu)中的核心部分.親核基團(tuán)和組氨酸殘基的位置是基本一致的， 不同之處在于羧酸殘基的位置。大多數(shù)日屬于

10、a/折疊型水解酶。隨著實驗設(shè)備及技術(shù)的不 斷提高改進(jìn)，根據(jù)序列分析、定點突變和X.射線衍射等實驗，研究者們發(fā)現(xiàn)了日的微觀 結(jié)構(gòu)，如圖所示。EH由兩個功能域組成：帽子結(jié)構(gòu)和核心結(jié)構(gòu)。帽子結(jié)構(gòu)由五個螺旋組成， 其大小在5.59個殘基之間，核心結(jié)構(gòu)加末端到C末端，是由8個D折疊片組成的區(qū)域，其長 度在16.57個殘基之間，具有一個催化性的三元組合，即：一個親核性的天冬氨酸殘基，一 個組氨酸殘基和一個傳遞電荷的天冬氨酸殘基。到目前為止，已有大量文獻(xiàn)報道研究EH催化環(huán)氧化物水解開環(huán)生成相應(yīng)二 醇的反應(yīng)122刃1。其催化過程是通過酶與底物共價結(jié)合形成中間體而開環(huán)，如 黑曲霉EH，如圖1. 3所示。催化反應(yīng)

11、從共價結(jié)合的乙二醇.單酯.酶中間體開始。 首先位于酶帽子結(jié)構(gòu)中的兩個酪氨酸殘基將環(huán)氧化物中的一個氧原子質(zhì)子化，然后酶 的一個天冬氨酸殘基進(jìn)攻該部分被質(zhì)子化的環(huán)氧化物，形成一個共價結(jié)合的中間 體，然后落入酶活性中心的一個水分子受到組氨酸殘基和另一個天冬氨酸殘基的 活化失去一個質(zhì)子，形成一個羥基，該羥基進(jìn)而進(jìn)攻乙二醇一單酯.酶中間體， 酪氨酸被還原，環(huán)氧化物被水解生成二醇。通過180標(biāo)記實驗，證實環(huán)氧化物水解 產(chǎn)生的二醇中的氧原子來自天冬氨酸殘基，而非被奪取了質(zhì)子的水分子。已報道的一種黑曲霉環(huán)氧化物水解酶的催化中心到目前為止，已有大量文獻(xiàn)報道研究EH催化環(huán)氧化物水解開環(huán)生成相應(yīng) 醇的反應(yīng)。其催化過

12、程是通過酶與底物共價結(jié)合形成中間體而開環(huán)，如黑曲霉 EH,如圖所示。催化反應(yīng)從共價結(jié)合的乙二醇.單酯.酶中間體開始。首先位 于酶帽子結(jié)構(gòu)中的兩個酪氨酸殘基將環(huán)氧化物中的一個氧原子質(zhì)子化，然后酶的 一個天冬氨酸殘基進(jìn)攻該部分被質(zhì)子化的環(huán)氧化物，形成一個共價結(jié)合的中間 體，然后落入酶活性中心的一個水分子受到組氨酸殘基和另一個天冬氨酸殘基的 活化失去一個質(zhì)子，形成一個羥基，該羥基進(jìn)而進(jìn)攻乙二醇一單酯.酶中間體， 酪氨酸被還原，環(huán)氧化物被水解生成二醇。通過七)標(biāo)記實驗，證實環(huán)氧化物 水解產(chǎn)生的二醇中的氧原子來自天冬氨酸殘基，而非被奪取了質(zhì)子的水分子。圖1-3環(huán)氧化物水解酶的催化機(jī)理前面敘述了 EH拆分

13、外消旋環(huán)氧化物的兩種機(jī)制，而并沒有涉及EH在拆分 環(huán)氧化物時的位置和立體選擇性問題。EH拆分環(huán)氧化物的實質(zhì)是一個動力學(xué)拆 16分問題?？梢岳斫鉃镋H對外消旋體R和S之一的選擇性更高，其被水解為二醇 的速度就快，二者水解速度的不同而達(dá)到分離尺和S的目的。之間涉及到一個 速度差的問題，即動力學(xué)拆分，如下所示：S-Lx RLY E：魄/昧 當(dāng)昧大于磚時，說明外消旋體中R水解為二醇的速率大于S。E是對映體 比率，表示拆分的效率，其值越大，說明該酶的對映體選擇性越強(qiáng)。在EH動力學(xué)拆分外消旋環(huán)氧化物，還涉及到一個手性中心構(gòu)型改變的問題。根據(jù)上述EH的催化機(jī)制，環(huán)氧化物水解時有兩條不同的途徑，如下圖1. 4

14、所 示Fig. 1-4 The two different hydrolyze approaches of epoxide hydrolaseR被活化的水分子進(jìn)攻取代較少的手性碳原子時，生成的二醇其手性中 心構(gòu)型保持不變；羥基進(jìn)攻取代較多的手性碳原子時，產(chǎn)物二醇的手性中心構(gòu)型發(fā)生翻 轉(zhuǎn)。上述兩種途徑中，羥基都是以反式方式進(jìn)攻的。只適用于環(huán)氧環(huán)中只有一個 手性碳原子的情況。若構(gòu)成環(huán)氧環(huán)的兩個碳原子都是手性分子，則無論羥基的進(jìn) 攻方式如何，產(chǎn)物二醇中的兩個碳原子的構(gòu)型都將發(fā)生翻轉(zhuǎn)。有報道，使用來自A. nige,.和Beauveria sulfurescens兩種立體選擇性互補的 環(huán)氧化物水解酶水

15、解苯乙烯環(huán)氧化物，結(jié)果得到了 ee值大于90%的R型對映體， 且實現(xiàn)了得率大于50% 251。四、應(yīng)用早期的研究工作主要集中在哺乳動物細(xì)胞中的EH,但是由于哺乳動物的酶量少，來源有 限，制約了它的實際運用。隨著微生物EH種類的增多，其應(yīng)用方面的研究也逐漸增多。許多 學(xué)者使用高的底物濃度和不同的反應(yīng)體系來擴(kuò)大拆分外消旋環(huán)氧化物的規(guī)模。JustineDeregnaucourt等使用A. nigerEH拆分三氟甲基取代苯基環(huán)氧化物，采用兩相反應(yīng)體系(有機(jī)相 -水相體積比為1:5),底物-酶的質(zhì)量比為58,底物濃度為360g/L (1.8mol/L), 4h后ee值可達(dá)到 99%。微生物EH催化生成的

16、有光學(xué)活性的環(huán)氧化物和二醇是有機(jī)合成的重要中間體。常用的催化 方式主要有三種:第一,采用單酶法。Daniel P. PienaarD等利用Yarrowia lipolyticaEH獲得了許 多手性的羥基化雜環(huán)類化合物，如S-3-羥基四氫呋喃、S-N-苯基-3-羥基毗咯烷、S-N-苯基-3- 乙酰氧基毗咯烷等,它們是合成雜環(huán)類藥物的重要前體物質(zhì)。XinJia等使用Sphingomonassp. HXN-200 EH拆分3-氯乙烷、苯基環(huán)氧乙烷,生成的S-3-氯苯基環(huán)氧乙烷可以進(jìn)一步合成 IGF-1R激酶抑制劑BMS-536924。這種拆分方式的不足在于產(chǎn)率不能超過50%。第二，采用 化學(xué)-酶法。Cleij等利用A.nigerEH拆分 4甲基-2-異丁基苯基環(huán)氧先得到S-環(huán)氧化物和R- 二醇,R-二醇用化學(xué)方法可以重新環(huán)化為消旋的環(huán)氧化物，然后繼續(xù)拆分，有效地提高了產(chǎn)率。S-環(huán)氧化合物開環(huán)后，可進(jìn)一步合成抗炎藥物S-2-異丁基苯丙酸(布洛芬)，同時得到R-構(gòu)型的 二醇，還可以環(huán)化為消旋的環(huán)氧化物,然后繼續(xù)拆分，這樣產(chǎn)物的循環(huán)利用有效地提高了產(chǎn)率。 第三,采用雙酶法。Li Cao等利用兩種選擇性互補的酶(Solanum tubero