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文檔簡介

1、PAGE 4PAGE 解惑練5CRISPR/Cas9技術1CRISPR/Cas9技術敲除掉部分基因原理(1)CRISPR/Cas9是細菌的一種后天免疫防御機制CRISPR序列示意圖如下(其中,菱形框表示高度可變的間隔序列,正方形表示相對保守的重復序列),其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質粒的一小段DNA,是細菌對這些外來入侵者的“記錄”。(2)病毒或外源質粒上存在“原間隔序列”,“間隔序列”正是與它們互相對應?!霸g隔序列”的選取并不是隨機的,這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個堿基往往都很保守,我們稱為PAM(原間隔序列臨近基序)。(3)當病毒或外源質粒DNA首次入侵到細菌體內時,細菌會對外

2、源DNA潛在的PAM序列進行掃描識別,將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”,將其整合到細菌基因組上CRISPR序列中的兩個“重復序列”之間。這就是“間隔序列”產生的過程。(4)當外源質粒或病毒再次入侵宿主菌時,會誘導CRISPR序列的表達。同時,在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因,稱為Cas基因。CRISPR序列的轉錄產物CRISPRRNA和Cas基因的表達產物等一起合作,通過對PAM序列的識別,以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補配對,來找到外源DNA上的靶序列,并對其切割,降解外源DNA。這也就實現(xiàn)了對病毒或外源質粒再次入侵的免疫應答。2CRISPR/Cas9技術的運

3、用和發(fā)展(1)具體運用如下圖所示,在待敲除基因的上下游各設計一條向導RNA(指導RNA),將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中,向導RNA通過堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列,Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。對于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件,生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制,會將斷裂上下游兩端的序列連接起來,從而實現(xiàn)了細胞中目標基因的敲除。(2)CRISPR/Cas9基因魔剪:當研究人員要用基因魔剪來編輯一個基因組時,他們會人工構建一個指導RNA,它與將要被切割的DNA代碼相匹配。魔剪蛋白Cas9與指導RNA形成復合物,將魔剪帶到基因組中將要進行切割

4、的地方。(3)原始的CRISPRCas9會由于RNA定位偏差而出現(xiàn)脫靶效應,現(xiàn)在通過改進,可以大幅降低脫靶效應。同時還發(fā)現(xiàn)了一些新的系統(tǒng),除了最開始的Cas9,后面又找到了Cas12的一系列酶,機理上有一定不同,但還是用以切割DNA;還有Cas13則用于切割RNA?;贑as12和Cas13的開發(fā)以及機制研究,又發(fā)展出了新的工具用于快速檢測病毒,效率可以達到幾分鐘檢測一個樣品,并且用到了現(xiàn)在的新冠病毒檢測中。跟蹤訓練1CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御機制,可用來對抗入侵的病毒及外源DNA,受此機制啟發(fā),科學家們研發(fā)了CRISPR/Cas9基因編輯技術

5、,這是一種對靶向基因進行特定DNA修飾的技術,其原理是由一個向導RNA分子引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列,可人為選擇DNA上的任一目標位點進行切割(見下圖)。請據圖分析回答下列問題:(1)CRISPR/Cas9基因編輯復合體中Cas9蛋白是由相應基因指導,在細胞的_中合成的,其工作原理是特異性地切斷目標DNA的_(填具體部位);向導RNA中的識別序列與目標DNA的識別遵循_原則,該復合體中,決定其在DNA上切割位點的是_。(2)中國科學家從肺癌患者血液中提取某種細胞,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術加入一個幫助這種細胞定向清除

6、腫瘤的新基因序列,然后再把這些細胞注入患者的血液,以達到殺死癌細胞的目的。這些細胞應該是人體的_,這種治療方法屬于_(填“體內”或“體外”)基因治療。(3)分析上述信息可知,CRISPR/Cas9基因編輯技術與早期基因工程相比最明顯的優(yōu)勢是_。答案(1)核糖體磷酸二酯鍵堿基互補配對向導RNA中的識別序列(2)T淋巴細胞體外(3)CRISPR/Cas9基因編輯技術可人為地選擇DNA上的目標位點進行切割,目的性更強解析(3)與早期基因工程相比,CRISPR/Cas9基因編輯技術可以對特定位點進行編輯,故其最明顯的優(yōu)勢是可人為地選擇DNA上的目標位點進行切割,目的性更強。2(2022湖南高三模擬)C

7、RISPR/Cas9基因編輯技術可以按照人們的意愿精準剪切、改變任意靶基因的遺傳信息,對該研究有突出貢獻的科學家被授予2020年諾貝爾化學獎。其原理是由一條單鏈向導RNA(sgRNA)引導Cas9蛋白到一個特定的基因位點進行切割,從而達到基因定點敲除、敲入、突變的目的。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列,可人為選擇DNA上的目標位點進行切割(如圖所示)。請據圖分析回答下列問題:(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術中,sgRNA是根據靶基因設計的引導RNA,準確引導Cas9切割與sgRNA配對的靶基因DNA序列。Cas9借助向導RNA對目標DNA分子進行精準定位,依賴于_;Cas9蛋白

8、能對目標位點進行準確切割,是因為_,由此可見,Cas9在功能上屬于_酶。(2)在使用Cas9對不同目標DNA進行編輯時,應使用Cas9蛋白和_(填“相同”或“不同”)的向導RNA進行基因編輯。在設計向導RNA識別序列時,若目標DNA的鏈切點附近序列為GAATCTCCA,則向導RNA上識別序列為_。(3)已知玉米中賴氨酸含量較低,原因是與賴氨酸合成過程中的兩個關鍵酶天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性,受細胞內賴氨酸濃度影響較大。當賴氨酸濃度達到一定量時就影響這兩種酶的活性,從而使賴氨酸含量很難提高,不能滿足需求?,F(xiàn)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術對天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶基

9、因進行改造,首先需要構建由啟動子、_(目的基因)、標記基因、終止子等組成的基因表達載體,然后使用_法導入玉米細胞,完成轉化后CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在玉米體細胞中特定的基因位點改寫遺傳信息,再經_技術培育成賴氨酸高產的玉米植株。答案(1)向導RNA識別序列與目標DNA之間的堿基互補配對Cas9蛋白能識別特定核苷酸序列并在特定位點斷開磷酸二酯鍵(Cas9蛋白具有專一性)限制性內切核酸(2)不同GAAUCUCCA(3)Cas9蛋白基因和sgRNA基因農桿菌轉化植物組織培養(yǎng)解析(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術中,sgRNA是根據靶基因設計的引導RNA,能準確引導Cas9切割與sgRNA配對的靶基因DNA序列。Cas9能借助向導RNA與目標DNA進行精確定位的原因在于向導RNA上的堿基序

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