菌株純化與細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)

1、 實(shí) 驗(yàn) 五菌株純化與細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)1目的要求加深對微生物分布廣泛性的認(rèn)識。平板菌落計數(shù)法。從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化菌株。掌握菌種保藏的準(zhǔn)備工作。細(xì)菌對大分子分解的檢測方法。2實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的微生物肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（現(xiàn)制）滅菌的培養(yǎng)皿酒精燈、接種針、試管、棉塞等菌種：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌。檢測用培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基（現(xiàn)制）LB培養(yǎng)基：下次實(shí)驗(yàn)使用。3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1：平板菌落計數(shù)含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個活菌細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落。故可根據(jù)平板上菌落的數(shù)目，推算出每克樣品

2、中所含的活菌總數(shù)。一般由三個稀釋度計算出的每克含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的總活菌數(shù)均應(yīng)很接近，不同稀釋度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。通常以第二個稀釋度的平板上出現(xiàn)50個左右菌落為好。4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：單菌落制備（細(xì)菌菌株劃線純化）5菌種保藏試管斜面冰箱保藏甘油管冷凍保藏（-20 or -80）冷凍真空保藏沙土管保藏液氮保藏6實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：細(xì)菌生理生化細(xì)菌生理生化反應(yīng)是菌種鑒定的重要依據(jù)主要根據(jù)不同微生物對不同生物大分子分解利用能力、代謝途徑、代謝產(chǎn)物不同，來達(dá)到菌種鑒定的目的7實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)菌種接種方式分工淀粉水解大腸枯草平板劃線(

3、+)每人一皿，分別接2種菌油脂水解大腸金葡平板劃線()每人一皿，分別接2種菌硫化氫產(chǎn)生大腸變形半固體穿刺2人一組，每人接1種菌至1支試管檸檬酸鹽大腸產(chǎn)氣斜面劃線()2人一組，每人接1種菌至1支試管按下表操作，統(tǒng)一培養(yǎng)，一周后觀察。8實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：細(xì)菌生理生化按下表操作，統(tǒng)一培養(yǎng)，一周后觀察。實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)菌種接種方式分工葡萄糖發(fā)酵大腸產(chǎn)氣菌體一環(huán)2人一組，每人接1種菌至1支試管M.R.試驗(yàn)大腸產(chǎn)氣菌體一環(huán)2人一組，每人接1種菌至1支試管V.P.試驗(yàn)大腸產(chǎn)氣菌體一環(huán)2人一組，每人接1種菌至1支試管吲哚大腸產(chǎn)氣菌體一環(huán)2人一組，每人接1種菌至1支試管9淀粉水解試驗(yàn)：某些細(xì)菌能夠分泌淀粉酶(胞外酶)，將

4、淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再變藍(lán)色。油脂水解試驗(yàn)：某些細(xì)菌能夠分泌脂肪酶(胞外酶)，能將培養(yǎng)基中的脂肪水解為甘油和脂肪酸。所產(chǎn)生的脂肪酸，可通過預(yù)先加入油脂培養(yǎng)基中的中性紅加以指示指示范圍pH6.8(紅)pH8.0(黃)。當(dāng)細(xì)菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時，培養(yǎng)基中比現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。10硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)：有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，可產(chǎn)生黑色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀，從而可確定硫化氫的產(chǎn)生。11檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：不同細(xì)菌利用檸檬酸鹽能力不同，有的細(xì)菌可利用檸檬酸鹽作為碳源，有的則不能。某些細(xì)菌將檸檬酸分解

5、為二氧化碳，培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而形成碳酸鈉，使培養(yǎng)基堿性增加。根據(jù)培養(yǎng)基中指示劑變色來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。指示劑可用溴麝香草酚藍(lán)(pH6時呈黃色，pH67.6呈綠色，pH7.6呈藍(lán)色)；也可用酚紅作為指示劑(pH6.3呈黃色，pH8.0呈紅色)。12糖或醇發(fā)酵試驗(yàn)：細(xì)菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油)的能力有很大的差異。有些細(xì)菌發(fā)酵某種糖后產(chǎn)生各種有機(jī)酸(如乳酸、醋酸、甲酸、琥珀酸)及各種氣體(如H2、CO2、CH4)。有的細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來指示。在配制培養(yǎng)基時可預(yù)先加入溴甲酚紫pH5(黃)pH7(紫)。當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵糖產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。

6、氣體的產(chǎn)生可由糖發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。13甲基紅(M.R.)試驗(yàn)：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，吸收培養(yǎng)基中的糖，然后分解為丙酮酸，丙酮酸再被分解為甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示。甲基紅的變色范圍pH4.2(紅色)pH6.3(黃色)。細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色變?yōu)榧t色，此為M.R.的陽性反應(yīng)。乙酰甲基甲醇(V.P.)試驗(yàn)：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸通過縮合和脫羧生成乙酰甲基甲醇，然后被還原成2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被氧化生成二乙酰，二乙酰可與培養(yǎng)基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物。此為V.P.試驗(yàn)的陽性反應(yīng)。14吲哚試驗(yàn)：有些細(xì)菌可分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚可與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。有些則不能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。15實(shí)驗(yàn)安排平板菌落計數(shù)清洗滅菌（上次結(jié)果較好的細(xì)菌培養(yǎng)平板不要清洗）肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備、分裝、滅菌，鋪制平板（保證至少每人1個平板、1支斜面試管）從上次細(xì)菌培養(yǎng)皿挑取菌斑，在鋪制好的平板上按分區(qū)劃線或連續(xù)劃線各劃一板制備適量淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基、醇發(fā)酵培養(yǎng)基，并接種制備LB培養(yǎng)基（下周使用）。16實(shí)驗(yàn)報告記錄所分離的微生物平板