半夏蛋白的分離純化及其對Hela細胞的生長抑制

1、 .en PAGE - 6 -半夏蛋白的分離純化及其對Hela細胞的生長抑制周旭鵬，楊煒鑫，童富淡，徐濤浙江理工大學生命科學學院 杭州310018E-mail：fdtong摘要：半夏是一種傳統(tǒng)的常用中藥。近年來的研究發(fā)現(xiàn)半夏蛋白在半夏眾多的化學成分中具有明顯的生物活性，是半夏抗腫瘤和抗生育等藥理作用的主要有效成分。本課題用Tris-HCl緩沖液對半夏總蛋白進行提取，再以硫酸銨的不同飽和度對其進行初分離，接著以凝膠層析對初分離得到的蛋白進行純化。最后用MTT法對分離得到的蛋白進行海拉細胞生長抑制試驗，檢測其體外抗海拉細胞效果。關(guān)鍵字：半夏蛋白；凝膠層析；電泳；MTT中圖分類號：Q8161.引言半

2、夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata( Thunb.) Breit 的塊莖, 是一種重要的中藥材。主產(chǎn)于甘肅、河南、四川、湖北、遼寧、陜西、山西、安徽、江蘇、浙江等地。半夏主要含有淀粉( 占75%左右) 、生物堿、半夏蛋白、- 谷甾醇、多糖、氨基酸、揮發(fā)油及無機元素等多種化學成分1-5。其藥理作用有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)；外用可治急性乳腺炎、急慢性化膿中耳炎等，是傳統(tǒng)的常用中藥之一；近年來研究發(fā)現(xiàn)，半夏還具有抗腫瘤、抗生育、降血脂和治療冠心病等重要藥理作用6-7。半夏蛋白具有抗腫瘤藥理活性8。癌癥已成為了嚴重危害人類生命健康、且難以治愈的疾病之一。為治療和預防各類癌癥，世

3、界各地的科學家和醫(yī)務(wù)工作者對其進行深入研究，特別是在有效治療藥物的研制開發(fā)方面做了大量的工作?，F(xiàn)在，許多科學工作者將目光投向了中國瑰寶-傳統(tǒng)中藥。中藥是中國幾千年傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的結(jié)晶。隨著研究的深入，人們對中國傳統(tǒng)的中藥、中醫(yī)對于一些惡性腫瘤的治療效果和潛在的醫(yī)療價值尤為關(guān)注：一方面是由于中國的藥物資源異常豐富，90年代全國中藥資源普查資料表明，我國目前的中藥資源種類達12 807種，這為抗腫瘤藥物的篩選提供了巨大的資源寶庫；二是因為中醫(yī)對中藥的獨特使用方法。本項研究通過Tris-HCl緩沖液進行提取、再對提取液進行硫酸銨分級鹽析的方法，從半夏塊莖中提取半夏總蛋白并初步分離半夏蛋白。借助凝膠層析

4、對得到的蛋白進行進一步的分離純化，得到純化的蛋白。利用在體外培養(yǎng)的癌細胞對在不同鹽飽和度所析出的半夏蛋白進行體外抗腫瘤活性的研究，利用MTT法檢測其對癌細胞的抑制生長效果。本課題得到浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（浙教高教200930號）資助。2.材料與方法2.1 材料三葉半夏塊莖采自山東菏澤。2.2 方法2.2.1 半夏蛋白的提取先將半夏塊莖用水浸泡一天，去皮、洗凈，稱取50g。接著將稱取的半夏塊莖置于研缽中，加入少量石英砂，研磨充分；在研磨過程中不斷加入總體積為200ml的0.05 M Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液。再將研磨好的溶液置于離心管（50ml）中，離心(10000rpm,

5、30min，40C)。分離兩相，收集上清液，置于大離心管中備用。2.2.2 半夏蛋白的初分離用量筒量取上清夜體積，再將上清液置于燒杯中，緩慢加入硫酸銨，調(diào)飽和度至 30%；放在40C冰箱中，鹽析過夜。將鹽析的樣品離心（10000rpm，30min，40C），分離兩相，分別收集上清液和沉淀。重復以上操作，將硫酸銨飽和度調(diào)至45%，60%和75%進行鹽析過夜，分離得到蛋白沉淀。半夏蛋白的純化用Sephadex（G-100）進行蛋白純化。用PBS緩沖液將蛋白沉淀溶解，上樣，以0.4ml/min的流速進行凝膠層析，根據(jù)核酸蛋白檢測儀，用試管收集樣品。蛋白濃度測定分別對初分離和純化得到的蛋白樣品進行濃度

6、測定。將經(jīng)過預處理的透析袋用PBS清洗干凈，用透析袋夾夾住一端，將蛋白樣品和裝入透析袋中，夾住另一端。將透析袋放入盛有PBS的燒杯中進行透析，每3小時換一次PBS，直至無硫酸銨為止。透析好的蛋白樣品進行離心（10000rpm，30min，40C），收集上清液。以酪蛋白為標準蛋白，用紫外可見分光光度法對半夏蛋白進行濃度檢測。SDS凝膠電泳 對初分離和純化得到的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，分析蛋白樣品分離純化效果。MTT法檢測分別將以飽和度為45%（組分一）和60%（組分二）進行鹽析并且經(jīng)過純化的樣品配制成終濃度為0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml的蛋白溶液。將對數(shù)生長期H

7、ela細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，再用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成濃度約為1106個/L的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100l。接著將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱中，在37，5% CO2條件下，培養(yǎng)，24h后補加100l RPMI1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）。取蛋白樣品各20l分別加入96孔培養(yǎng)板的各孔中。對照組加20 ul PBS溶液。繼續(xù)培養(yǎng)至24小時。每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，37溫育4h，小心吸去孔板中的培養(yǎng)液后每孔加入200l DMSO，在恒溫振蕩器上震蕩5min。在上述條件下，用自動酶標儀在波長490nm處測定每個孔的吸光值（OD值）。

8、抑制率（%）=(對照組 - 實驗組)/對照組*100% 。3. 結(jié)果3.1 紫外可見分光光度測定3.1.1 初分離得到的蛋白濃度測定圖1.蛋白濃度標準曲線表1.初分離蛋白濃度統(tǒng)計表 硫酸銨飽和度30%45%60%75%A2800.2620.430.320.175蛋白濃度(mg/ml)0.658 1.079 0.803 0.439 初分離蛋白含量（mg）5.06641.00212.8484.393.1.2 純化后蛋白濃度測定圖2. 蛋白濃度標準曲線表2.純化后蛋白濃度統(tǒng)計表硫酸銨飽和度45%第一組分45%第二組分60%第一組分60%第二組分A2800.2390.3690.0510.151純化蛋白

9、濃度(mg/ml)0.254 0.378 0.075 0.170 3.2 SDS凝膠電泳圖3.初分離蛋白的SDS凝膠電泳M：SM0431 protein marker 1：飽和度45% 2：飽和度30% 5：飽和度60%圖4.飽和度60%凝膠層析后不同組分的SDS凝膠電泳M: SM0431 protein marker 1：飽和度60%色譜第一組分2：飽和度60%色譜第二組分 3：飽和度60%色譜第三組分4：飽和度60%色譜第四組分 5：飽和度60%色譜第五組分 6：飽和度60%3.3 MTT檢測4.討論半夏是一種傳統(tǒng)的常用中藥。近年來的研究發(fā)現(xiàn)半夏蛋白在半夏眾多的化學成分中具有明顯的生物活性

10、，是半夏抗腫瘤和抗生育等藥理作用的主要有效成分。本課題用Tris-HCl緩沖液對半夏總蛋白進行提取，再以硫酸銨的不同飽和度對其進行初分離。從紫外可見分光光度法和SDS（圖3）的結(jié)果可以看出，在飽和度30%至60%之間有大量的蛋白析出，其中從30%到45%析出的蛋白最多。電泳圖顯示，經(jīng)過不同飽和度硫酸銨的初分離，總蛋白能夠得到一定程度的分離；但是由于含有大量的不同蛋白，導致初分離效果不是很好。所以，接著用凝膠層析對初分離得到的蛋白進行純化。由于一些客觀原因，實驗只進行了飽和度為45%和60%的凝膠層析。圖2顯示，飽和度為60%的蛋白能夠進一步地得到分離純化。最后用MTT法對分離得到的蛋白進行體外

11、細胞試驗，檢測其體外抑制海拉細胞生長的效果。從圖5可知飽和度為60%（組分二）的抑制效果好于飽和度為45%（組分一）的抑制效果。而且圖中還顯示，0.1mg/ml（45%）的抑制效果低于0.05mg/ml的抑制效果。這可能是由于樣品中還含有雜蛋白，不同的蛋白之間相互作用較強，影響其抗腫瘤作用。參考文獻1 樓之岑, 秦波.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究( 北方篇)M .北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社, 1995: 9l9- 920.2 李先端,胡世林,楊連菊.半夏類藥材氨基酸與無機元素分析J.中國中藥雜志,1990, 15( 10):37.3吳皓.半夏姜制對且谷甾醇和總生物堿含量的影響

12、J中國中藥雜志，1995，20(11)：6624吳皓.半夏的化學成分研究J.中草藥,2003,34(7):5935郭巧生.半夏不同居群3種化學成分的動態(tài)比較研究J.中國中藥雜志.2001，26(5)：2966 黃必勝.半夏蛋白對人肝癌細胞Bel-7402 的誘導凋亡作用J.時珍國醫(yī)國藥,2007,18 (5):1056.7 梁永恒,劉小川,傅強.兩種半夏蛋白及凝集素抑制褐飛虱與番茄花葉病毒初報J. 湖南農(nóng)業(yè)科學,2007,2:93.8 毛子成,彭正松.半夏研究進展J.江西科學,2002,20(1):4246.Pinellia protein Purification and Experimen

13、tal Study on Inhibiting Growth Efects of it on HelaZhou Xupeng,Yang Weixin,Tong Fudan,Xu TaoCollege of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Zhejiang Hangzhou (310018)AbstractPinellia is a traditional Chinese medicine. In recent years, studies have found that Pinellia protein have significant

14、 biological activity in many chemical compositions of Pinellia ternate. And Pinellia protein is the main active ingredient of Pinellia that have pharmacological effects of inhibiting tumor and fertility. Use Tris-HCl buffer to extract total protein of Pinellia ternate, then the different ammonium sulfate saturation were used to salt out the said total protein of Pinellia ternate, foll