AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程

1、AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism（AFLP）是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)，具有RFLP技術(shù)高重復(fù)性和RAPD技術(shù)簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標(biāo)記一樣對(duì)基因組多態(tài)性的檢測(cè)不需要知道其基因組的序列特征，同時(shí)彌補(bǔ)了RAPD技術(shù)重復(fù)性差的缺陷。同其他以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)相比，AFLP技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)到大量的位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記。此技術(shù)已經(jīng)成功地用于遺傳多樣性研究，種質(zhì)資源鑒定方面的研究，構(gòu)建遺傳圖譜等。其基本原理是：以PC

2、R（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）為基礎(chǔ)，結(jié)合了RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）的分子標(biāo)記技術(shù)。把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補(bǔ)的但3-端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3-端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增），再在有高分辨力的測(cè)序膠上分開(kāi)這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測(cè)之。一、實(shí)驗(yàn)材料采用青稞葉片提取總DNA。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備1美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)MJ公司PCR儀，安瑪西亞電泳儀等。三、實(shí)驗(yàn)試劑1.試劑：請(qǐng)使用高質(zhì)量

3、產(chǎn)品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關(guān)產(chǎn)品。DNA提取試劑盒；EcoRI酶,MseI酶，T4連接酶試劑盒；Taq酶，dNTP,PCRreactionbuffer；AFLP引物；瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無(wú)毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料;超純水（18.2MQcn）2其他實(shí)驗(yàn)需要物品微量移液槍（一套）及相應(yīng)尺寸Tip頭,PCR管，冰浴等。四、實(shí)驗(yàn)流程1、總DNA提取使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)或用標(biāo)準(zhǔn)品跑膠檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，100ng的基因組DNA作為反應(yīng)模板是足夠的。2、EcoRI酶消化（20ul體系/樣品）37C2hrs65C30min終止反

4、應(yīng)EcoR11ul(10U/ul)10XBuffer2ulsample(總DNA)5ulddH2O12ul3、Msel酶消化（20ul體系/樣品）TOC o 1-5 h zMsel2ul（lU/ul）= HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 10XBuffer2ulsample（EcoR1酶切產(chǎn)物）15ulC65C2hrs80C30min終止反應(yīng)ddH2O1ul/4、T4DNALigase（20ul體系/樣品）接頭退火65度10分鐘25度2小時(shí)2ul（1U/ul）2ul10ulI1ul（不稀釋）22C3hrs1ul稀釋10倍4ulT4DNALiga

5、se10XBuffer65C10min終止反應(yīng)sample（雙酶切產(chǎn)物）Mse1AdaptorEcoR1AdaptorddH2O5、預(yù)擴(kuò)增（20ul體系/樣品）TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark24 o Current Document sample4ulPrimer（Mse1/EcoR1）1ul（100uM分別稀釋14倍）AFLPCoreMix15ul*AFLPCoreMix配方：ddH2O8.8ulMgCl21.6uldNTPs（2.5mM）1.6ulTaq酶（1U/ul）1ul10XBuffer2ul預(yù)擴(kuò)增程序：94C2min94C20s、56C30sx

6、20cycles72C2min60C30min6、選擇性擴(kuò)增（20ul體系/樣品）sample4ul（預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍）Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX）1ul（M引物100uM稀釋14倍，E引物100um稀釋100倍）TOC o 1-5 h zAFLPCoreMix15ul選擇性擴(kuò)增程序：94C2min94C20s、66C30s每循環(huán)降1C,共10個(gè)循環(huán)72C2min丿94C20s*56C30s20個(gè)循環(huán)72C2min60C30min7、產(chǎn)物電泳檢測(cè)上樣液：LoadingBuffer20ul旦fflj剛ISBI4IQ曰口注靈科A耳UtZSMHSizestandard-6

7、00Sample0.2ul3ul（稀釋10倍）四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析本實(shí)驗(yàn)使用貝克曼庫(kù)爾特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運(yùn)用先進(jìn)的熒光標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，采用激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，靈敏度極高，電泳結(jié)果通過(guò)軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)換成“0、1”矩陣，便于對(duì)結(jié)果進(jìn)一步深入分析研究，整個(gè)電泳、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析過(guò)程由軟件來(lái)控制完成，最大程度避免了人工操作造成的誤差，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。產(chǎn)物電泳數(shù)據(jù)采集在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行（圖1），得到的數(shù)據(jù)（圖2）用第三方軟件再進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。圖1AFLP分子指紋圖譜fFB

8、orimW-JtiMAAaIMHFAj-?G.-AA,P-AflJJIIV&*礙3Jh班WlXlW賊唄匝叵阪lTuiDlgJLiT.snTr-nJrrsrTajli越為規(guī)H劉IDgaoJ7153ow002owqlnl3lj2l衛(wèi)盜33NTIJCMIZ:KfcSS3殆:Ji1.6?3I瘀JI5J17JITiK:33i23血器M1.3&陰總ME肝:KGLIOkFIMamliM|aaaaiaQ0iaoiamant1021H|w“iUfAamowl（00a00?an?aqiamFF1F1FrmmFinnEinIDldIdIdnfiinEicnEnEiEiniiMrirlr|rjilrjalanlnln

9、lqalaI-alalnilFKFlFin17區(qū)旦腳同F(xiàn)FrnmrkbuITI斤nmEnnnrnFIFl冋-FllpHt-廠匚rlm-材r昭KFnKITL3黑一器黑討nrlIil-dQPT右p亍十丿7TFLHRp訂I“jjln1hi7訂門|ni11nn|ajn|iDHirdnlnnlBlidrLijJLJJjJj-llnlglnlnRHIDlDlDDIDIDIDIIIIIQI門IIIIPlEEInncintir*mriKKiEinEiiEiiFiIVlVilmTEilEilEilEiiEilEllHalbI匚如F鈕IIIDt：akriFgjEp*i3tlniNsui歸止0時(shí)ILU己工SnS町F

10、itimP曰回圍詐血粉臧!抽fi脳g噲,M_廠Fi*#MiaMuVr田REYgdESf*.irhidncHIUHl葉rIIl1314如卜.為宜；|H|i9iam:|H芒單曲盤kwIwu-KMSatiK?WiwIff-芒“圖2AFLP“0、1”矩陣圖AFLP操作流程圖：總DNAEcoRl酶切Msel酶切連接接頭預(yù)擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增H優(yōu)化電泳檢測(cè)|數(shù)據(jù)分析附錄1：常用的8對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物：E-AGG:5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E-ACG:5-GACTGCGTACCAATTCACG-3E-AAC:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E-ACA:5-GACTGCGTA

11、CCAATTCACA-3E-AGC:5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E-ACT:5-GACTGCGTACCAATTCACT-3E-AAG:5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3E-ACC:5-GACTGCGTACCAATTCACC-3M-CAA:5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC

12、-3M-CTG:5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3附錄2：AFLP傳統(tǒng)垂直板電泳(銀染法檢測(cè))介紹：原理與方法同前，區(qū)別：1.選擇性擴(kuò)增引物不帶熒光標(biāo)記；2電泳方法不同，采用測(cè)序膠垂直板電泳；3電泳結(jié)果采用銀染法，比較直觀，但條帶的統(tǒng)計(jì)與分析全人工化，工作量大，銀染法靈敏度比熒光標(biāo)記法要低。示例：下圖為玉米(maize)DNA的AFLP圖譜。24S100_1o5PanelA:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoRIprimerE-AGGwitheightMselprimers:M-CAA(1),M-CAC(2),M-CAG(3),M-CAT(4),M-CTA