抗氧化酶SOD、POD、CAT活性測(cè)定方法

1、 抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測(cè)定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定（氮藍(lán)四唑光化復(fù)原法）1、試劑的配制1）005mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.8）:母液：02mol/L磷酸氫二鈉溶液：取Na2HPO412H2O（分子量35814）717g；母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO42H2O（分子量15601）312g。分別用蒸餾水定容到1000ml。005mol/LPBS（pH78）的配制：分別取A母液（Na2HP04）22875ml,B母液（NaH2PO4）21.25ml,用蒸餾水定容至1000ml。參照文件：李合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)高等教

2、育第一版社，2000：267268。2）145mM甲硫氨酸溶液：取21637gMet用磷酸緩沖液（pH78）定容至1000ml。（3）30uMEDTA-Na溶液：取0.001gEDTA-Na用磷酸緩沖液定容至100ml。22（4）60uM核黃素溶液：取00023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml,避光保留。5）225mM氮藍(lán)四唑（NBT）溶液：取01840gNBT用PBS定容至100ml,避光保留。酶液制備：取02g（可視狀況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH78）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4C、12000g下離心

3、20min,上清液即為酶液。2、酶活性測(cè)定1）反響混淆液配制（以60個(gè)樣為準(zhǔn)）：分別取Met溶液162ml,EDTA-Na溶液06ml,2磷酸緩沖液5.4ml,NBT溶液6ml,核黃素溶液6ml,混淆后搖勻；（2）分別取3ml反響混淆液和30ul酶液于試管中光照下反響（3）將試管置于光照培育箱中在4000lux同時(shí)做兩支比較管，此20min；中后測(cè)定作為最大光復(fù)原管，1支試管取3ml反響混淆液加入30u1PBS（不加酶液）照光1支只加緩沖液置于暗中測(cè)準(zhǔn)時(shí)用于調(diào)零。（4）以不照光的比較管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光0D560（出現(xiàn)顏色即測(cè)可測(cè)定）?？寡趸窼OD、ODCA活性測(cè)定方法 酶

4、活性計(jì)算：SOD活性單位以克制NBT光化復(fù)原50%所需酶量(測(cè)的樣品值要在最大管的一半左右才適合，不然要調(diào)整酶量)為1個(gè)酶活單位(u)。SOD總活性=(Ack-AE)XV/(1/2AckXWXVt)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW)；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；A為照光比較管的吸光度；A為樣品管的吸光度；V為樣品液整體積(ml,16ml,加入PBS的體積)；Vt為測(cè)準(zhǔn)ckE時(shí)的酶液用量(ml,30ul)；W為樣品鮮重(g,測(cè)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg)；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測(cè)定粗酶液制備同SOD。1、過(guò)氧

5、化物酶(POD)活性測(cè)定(愈創(chuàng)木酚法)試劑配制：0.2mol/L磷酸緩沖液(pH60)：分別取A母液(Na2HP04)123ml和B母液(NaH2P04)877ml混勻即為1000mlPBS(0.2M,pH6.0)；反響混淆液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：取200mlPBS(02M,pH60),加入0076ml液體(原液)愈創(chuàng)木酚(2-甲氧基酚)加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml30%的H0,混勻后保留于冰箱中備用。22樣品測(cè)定：要保證每個(gè)樣品從加好樣到開(kāi)取3ml反響液并加入30ul酶液，以PBS為比較調(diào)零，爾后測(cè)定OD470值(測(cè)定40秒)。邊加樣邊測(cè)定,測(cè)定前等候5秒,動(dòng)作要快,假如慢的話,

6、始記時(shí)的時(shí)間相差不大)(4)酶活性計(jì)算：以每minOD值變化(高升)001為1個(gè)酶活性單位(u)。POD=(A470XVt)/(WXVsX001Xt)(u/gmin)A470：為反響時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反響時(shí)間(min)；Vt為提取酶液整體積(ml,(16ml)；Vs為測(cè)準(zhǔn)時(shí)取用酶液體積(ml,30ul)。2、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定1)試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)：取A母液(Na2HP04)4575ml和B母液(NaH2P04)2925ml混淆后用蒸餾水定容至1000ml。(2)反響液配制：取200mlPBS(015M,pH7.0)，加入0

7、3092ml30%的H0(原液)搖勻22即可。測(cè)定(3)樣品測(cè)定：取3ml反響液加入0.1ml(可視狀況調(diào)整)酶液，PBS為比較調(diào)零，0D240(紫外)(測(cè)定40s)。(4)酶活性計(jì)算：以每min0D值減少0.011個(gè)酶活性單位u)為(CAT=A240XVtX(u/gmin)(/WXVsX0.01t)A240：為反響時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；為反響時(shí)(min)；為提t(yī)間Vt取酶液整體積ml，1.6ml)；Vs為測(cè)準(zhǔn)時(shí)取用酶液體積(ml,0.1ml)。四、超氧陰離子自由基(02.-)產(chǎn)生速率的測(cè)定(羥胺氧化法)21、試劑的配制(1)1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用

8、蒸餾水定容至300ml；(2)17mM對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對(duì)氨基苯磺酸用少許冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=1：3配制)加熱溶解后定容至400ml；(3)7mMa-萘胺溶液：稱取0.4008ga-萘胺用冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=3：1配制)定容至400ml。2、02.-含量的測(cè)定2(1)樣品液提取方法同SOD測(cè)定；(2)取05ml提取液(酶液)(可視狀況調(diào)整用量)中加入05mlPBS(005M,pH7.8),1ml1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。3)在25C下保溫1小時(shí)；抗氧化酶SOD、ODCA活性測(cè)定方法9 #4）挨次先加入1ml17mM對(duì)氨基苯磺酸，再加入1ml7mMa-萘胺，混淆后迅

9、速搖勻；5）在25C下保溫20min后在3000Xg下離心3min后立刻進(jìn)行測(cè)定（或置于冰箱待測(cè)）6）以比較管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測(cè)定OD530值（測(cè)定）；依據(jù)羥胺與02.-2（7）0-含量的計(jì)算：由測(cè)得的0D530,查N0-標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得N0-；222抗氧化酶SOD、ODCA活性測(cè)定方法抗氧化酶SOD、ODCA活性測(cè)定方法 .-的反響式：NH20H+202-+N02-+H202+H20計(jì)算02.-,即NO2X2=O再H依據(jù)樣品與羥胺反響的時(shí)間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得0-產(chǎn)生速率(以nmolmirnmg-i2蛋白表示，也能夠nmolmin-ig-i鮮重表示)。1-10產(chǎn)生速率=(C

10、XV)/(tXW)(nmolming鮮重)2(umol/L)；V為測(cè)準(zhǔn)時(shí)所取提取液用量(葉綠體稀釋后的C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度體積);t為反響時(shí)間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實(shí)質(zhì)質(zhì)量g)參照文件：信，羅廣華植物生理學(xué)通1990,(6)：5557五、丙二醛含量的測(cè)定1、試劑配制：10%TCA：100g三氯乙酸-IL0.67%TBA：335g硫代巴比妥-500ml10%TCA(避光)酸2、測(cè)定步驟開(kāi)水0.2樣品+16ml10%TCA研磨f12000g離10min-上1.5ml+1.50.67%TBA清煮30min-冷卻，離心上清0D450,0D532,0D6003、計(jì)算組織中MDA含量:M

11、DA濃度C(umol/L)=645(0D5320D600)0.560D450MDA含量(umol/gFW)二CXV/W式中V為提取液體積(1.6ml),W為樣品鮮重(02g)六、植物細(xì)胞質(zhì)膜透性的測(cè)定(電導(dǎo)儀法)1)取新鮮葉片或根系(不可以萎蔫)0.3g，用自來(lái)水沖刷表面污漬，再用去離子水沖刷幾遍后用吸水紙吸干水分；(2)樣品剪碎(也可打孔取樣)放入試管(或15ml大離心管)中，加10ml去離子水，在室溫下擱置3h使葉片充足吸水后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R1)；3)再放入恒溫水浴鍋中在100C開(kāi)水浴中煮20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R2)；4）用公式計(jì)算質(zhì)膜相對(duì)透性（用相

12、對(duì)電導(dǎo)率表示）：相對(duì)電導(dǎo)率（）=R1/R2X100%還能夠計(jì)算植株損害程度：100%損害率二（辦理電導(dǎo)率一比較電導(dǎo)率）/（煮沸電導(dǎo)率一比較電導(dǎo)率）X七、可溶性蛋白含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在留宿后過(guò)濾并貯于棕色瓶中，常溫可在暗中保留一個(gè)月。（2）100ug/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mgBSA加水溶解后定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml再?gòu)闹屑橙?0ml用蒸餾水定容至即為標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液）。2、樣品可溶性蛋白含量的測(cè)定（1）樣品可溶性蛋白含量測(cè)定：取磷酸緩沖液（即稀釋成響2min后測(cè)OD595（以100口緩沖液加100ml，100u