HPLC樣品前處理技術(shù)課件

1、 高效液相色譜樣品前處理技術(shù)在做樣品之前首先要知道樣品大致情況是純品還是粗品，如果是粗品是哪一類的原料。要了解待測(cè)組份的性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，才能夠?yàn)闃悠返那疤幚砗蜕V條件的選擇打基礎(chǔ)。上機(jī)分析之前 ，準(zhǔn)備好樣品、選擇好色譜條件、保證儀器正常運(yùn)行。注：樣品在上機(jī)分析之前一定要過濾 流動(dòng)相要過濾、脫氣鑲箍狽喪崎扯痔誕堿覓家鈾搽派踏禱桶努旱烹詭爸軸官借袖奧撕祥焊檀佳HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第1頁，共30頁。在復(fù)雜基體中低濃度有機(jī)化合物的分離和測(cè)定是分析化學(xué)所面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)雖然分析儀器的自動(dòng)化程度日益提高，但在發(fā)展分析方法的同時(shí)，人們或多或少忽視了樣品的預(yù)處理問題。然而在分析復(fù)雜樣品，

2、如生物樣品、環(huán)境樣品、植物樣品等，為了獲得比較可靠的鑒定結(jié)果,必須花費(fèi)很多的人力和經(jīng)費(fèi)，并且由于前處理步驟多，如果前處理不當(dāng)，往往會(huì)使全過程的回收率降低，會(huì)發(fā)生定性定量錯(cuò)誤和色譜柱壽命縮短等問題因此，提高和掌握樣品的前處理技術(shù)是完善檢測(cè)全過程的重要環(huán)節(jié)。目前仍沿用溶劑提取、色譜分離或液-液分配等純化方法。熟秒浴營會(huì)疚目媚氣雛骨荒煤紀(jì)棧常南轅肥士毅攬撞甕霍歲綽環(huán)墨嫁飼盯HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第2頁，共30頁。 樣品預(yù)處理的內(nèi)容繁多，如液體樣品： 直接上機(jī)、稀釋、富集、抽提、離心、 過濾后上機(jī)固體樣品：溶解、離心、萃取生物樣品（如，血液、尿液、動(dòng)物組織及器官等樣品）：預(yù)處理

3、搶注覽番宏逞柞考釀乏墻援羔掃擔(dān)商破洼稿鏟討目洪怪撻碉俯瀾里袖酞椎HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第3頁，共30頁。一般說來，樣品預(yù)處理要達(dá)到的目標(biāo)如下： 1去除基體中干擾樣品分析的雜質(zhì)，提高分析精度和分離效果； 2提高被測(cè)定化合物檢測(cè)靈敏度； 3提高樣品與流動(dòng)相的兼容性，從而改善 定性定量分析的重復(fù)性弟重圭碴細(xì)荊縣疑力粳嶼固灼鼓月官羌份羞禁樟顫推念峙卉萬攪啃褥擬疑HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第4頁，共30頁。 高效液相色譜分析樣品時(shí)沒有統(tǒng)一的前處理方法。必須根據(jù)樣品的種類和待測(cè)項(xiàng)目決定前處理方案，但原則上仍應(yīng)考慮幾下操作環(huán)節(jié)：如取樣、試樣的調(diào)制、提取、純化、濃縮等步

4、驟，至于各種具體樣品的前處理可以進(jìn)一步參考有關(guān)資料。扮廖藍(lán)砷糖對(duì)禿拓云酪糙愉震航蒼糧蘿貯證梨窩鑰穗全危蠅渙酒愉胖摯癱HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第5頁，共30頁。 （一）取樣與調(diào)制 固體塊狀樣品的取樣與調(diào)制為了得到較為可靠的結(jié)果，取樣的代表性極為重要。一般取樣操作要點(diǎn)可概括為：第一步隨機(jī)抽樣，抽樣量要根據(jù)樣品數(shù)量而定，第二步再按四分法將試樣縮分到所需的量，第三步再取所需的量。樣品得到后必須進(jìn)行粉碎和混勻，小量樣品可以使用研缽，較多的試樣可使用電動(dòng) 粉碎機(jī)粉碎。粉碎后，應(yīng)通過20一30目篩孔用篩過篩，混合均勻，制得試樣。主倡艱沈縱臥蘇悲鞏牛煽賺褐扯民問鄉(xiāng)捐濤稀浚地祈炭伺筋鑲妮怔焰

5、是楷HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第6頁，共30頁。當(dāng)試樣含水分較多而較難粉碎時(shí)，特別是待分析的成分不會(huì)因干燥而發(fā)生變化時(shí)，需進(jìn)行予干燥。一般將已粉碎的試樣置于60烘箱中烘12小時(shí)，稱取干燥前后的重量，分析維生素類的物質(zhì)時(shí)通常不進(jìn)行予干燥。當(dāng)待測(cè)成分會(huì)因干燥而分解時(shí)，只能將原樣進(jìn)行研磨，或加適量溶液研磨，使其成為均勻的分析試樣。水果等樣品可使用研缽。魚肉等樣先用小刀切成小塊后，用絞肉機(jī)絞碎。水果糖等樣，能簡(jiǎn)單溶于水或適當(dāng)?shù)娜軇?，可制成溶液，攪拌勻。油脂類也能一次性溶解，使其成為溶液、混勻。牛奶等，因比重不同，溶液上下不均勻，這時(shí)可將玻璃管插到底部，在所有的層次取樣，或者用攪拌棒攪

6、勻，取其攪勻的樣品。啤酒、汽水等含碳酸的飲料，在20一25度加熱，完全逐出碳酸后再進(jìn)行分析。貝殼類除去殼，僅將貝肉磨碎。干魚可直接粉碎制備試樣。鑰矽泛羚接邵紡撲誼弄霹濕鎬需搔燼桑爍茶等罩賂蟬輪科芋液屈獸掏籮醇HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第7頁，共30頁。 （二）提取方法 提取方法：液-液萃取液-固萃取超聲波萃取微波萃取膜技術(shù)：微滲透 超濾膜技術(shù)忿樁探開色爾慮笨焊痙誹疵菱喬鞭指虜財(cái)躍藥瓣硅竄母繞賦襟翠炮獺忘猖HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第8頁，共30頁。從技術(shù)角度而言植物及食品樣品分析最為困難的是：待測(cè)成分從樣品基體中將其分離。目前，常用的提取分離方法仍采用溶劑提

7、取法選擇提取溶劑時(shí)，應(yīng)考慮到： 1、提取溶劑是否會(huì)與待測(cè)成分發(fā)生反應(yīng)； 2、欲分析物質(zhì)的極性； 3、欲分析物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性； 4、欲提取樣品的類型(含水多、含油多、干材等）； 5、溶劑的毒性； 6、溶劑的揮發(fā)性 7、溶劑的純度； 8、溶劑的價(jià)格等。釣?zāi)粨?jù)礫亢蠱孤紅房熊靈罩擦醫(yī)邱兢譚卻吹喳墜笑射貿(mào)訣星度潑佐涪汐疽HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第9頁，共30頁。一般親水性溶劑應(yīng)用于提取親水性化物，而疏水性溶劑最適宜提取脂溶性和油溶性化臺(tái)物。欲分析物質(zhì)在溶劑中的溶解度是選擇最適宜溶劑時(shí)的另一個(gè)重要因素。不同類型的樣品需要不同的溶劑。一般用水溶性溶劑提取含水量高的樣品。而用乙腈提

8、取脂溶性或油溶性樣品。氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最適宜溶劑。如果有多種溶劑都適用于提取，那么應(yīng)該首先選用毒性最小的溶劑以保護(hù)分析人員的身體健康。 猿漱庭庶鯉莎燭樟疫者產(chǎn)醫(yī)矢覆棒遏占端蔽戮癸捉锨闊膀冬奪銘矯紀(jì)鹽忠HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第10頁，共30頁。在控制監(jiān)測(cè)中，當(dāng)被測(cè)成份和樣品類型已知時(shí)，理論上可選擇最合適的溶劑。根據(jù)樣品類型和被測(cè)成份種類使用不同方法進(jìn)行提取。在實(shí)際工作中最廣泛使用的提取溶劑有： 二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、 苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它們 的混合劑。在此基礎(chǔ)上可以得知有廣泛適用性的使用方案(溶劑樣品化合物基體)綏慣掏濟(jì)港來衷藕勛

9、翻庭談寫脆洱描宜桑風(fēng)酪齊栽汗祖薛射伙熊餅研聚傅HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第11頁，共30頁。1、液液分配法提取樣品。采用液液分配法可把不同溶解度的化合物分開。正確選擇萃取溶劑即可把被測(cè)成份萃取出來，使其與大多數(shù)共萃物分開，色譜分離情況與樣品大小有關(guān)。隨著樣品大小增加，分離情況變差，因此樣品大小無限度地增加會(huì)使分配系數(shù)和分離效率降低。締叫孕唱剔迄當(dāng)滓咐勛借攏省撞吁兒氫蕾醞伊鐘拜候尿諄虎烯優(yōu)肪姻孽胳HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第12頁，共30頁。液-液萃取最早被用于樣品的預(yù)處理，這一方法可把有機(jī)化合物直接萃取到與水不相溶的有機(jī)相中，在一定溫度下，溶質(zhì)在兩種互不相溶

10、的溶劑分配時(shí)，平衡濃度之比為一常數(shù)，這一常數(shù)稱為分配常數(shù)。只有中性分子才能被萃取，兩相中溶質(zhì)總濃度之比為分配系數(shù)，溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)與選用的萃取溶劑、水相的pH和有機(jī)溶劑與水相的體積比值相關(guān)。液-液萃取盡可能選用溶質(zhì)有較大溶解度的有機(jī)溶劑，如果溶質(zhì)的萃取回收率較低，可通過連續(xù)多次萃取提高回收率，通常采用過量的有機(jī)溶劑來萃取，以節(jié)省時(shí)間。蜜繳文涉孿俄晚塢矛焚券緞孝蕾生薛降掇抹馳試偶乍贍痞瑯藤房嗎如證囪HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第13頁，共30頁。1.1、萃取溶劑的選擇被測(cè)化合物的相對(duì)疏水性將決定萃取溶劑的選擇，用于液-液萃取的有機(jī)溶劑必須滿足：（1）沸點(diǎn)低，以便可以在完成液

11、-液萃取后很快可將有機(jī)溶劑揮發(fā)；（2）溶劑的粘度低，以使與樣品基本相混合，下表是按溶劑極性排序的一些常用液-液萃取溶劑，表中有機(jī)溶劑在水中的溶解度是一個(gè)重要的因素，溶劑在水中的溶解度對(duì)萃取液中的共萃取干擾物質(zhì)的含量有重要的影響，一般來說，萃取的有機(jī)溶劑極性越小，萃取的選擇性越好，因此，選擇液-液萃取的有機(jī)溶劑在能溶解樣品的前提下，極性應(yīng)盡可能低。施靡詩喝弊乍銳畦郡敝攀懼憋糞鋁紹瀝紳謙趟曉經(jīng)詩騰獲絕滓值頑捻召蔗HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第14頁，共30頁。表：一些常用液-液萃取有機(jī)溶劑的物理化學(xué)性質(zhì)溶劑沸點(diǎn)（）溶劑極性（）在水中的溶解度（%）正己烷690001環(huán)己烷810001

12、氯仿6144082二氯甲烷4034130乙醚35604乙酸乙酯7743808站芍廣逗鉀嫌車饞粗扣揍審睬達(dá)撒牟策嘎爐孔霜繞仙狄素嗣縛檀書捻壤是HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第15頁，共30頁。1.2 pH值的控制 液-液萃取所采用的pH值應(yīng)使被萃取的樣品的萃取的有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）具有良好的穩(wěn)定性，為了使萃取過程有良好的回收率，應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)水相的pH使溶質(zhì)以中性狀態(tài)存在，如有機(jī)酸為例，其在水相和有機(jī)相的分配過程存在以下平衡： HL HL0 H+L- HL 有實(shí)驗(yàn)表明，一元羧酸在水相的pH值低于3.0時(shí)可以很好地被萃取到有機(jī)相中，而當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，則主要溶解在水相中，很難被有機(jī)相

13、萃取，利用pH值對(duì)分配系數(shù)的影響，可以將有機(jī)酸或有機(jī)堿從水相萃取到有機(jī)相中，反之可以把有機(jī)相中的弱酸、弱堿萃取到水相中， 藏萌般聾諷陣捶竄回盯腐咒筑蒜手至鏈疾珍獰舵非匡瓷鼠濘份拂乳攏辨稼HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第16頁，共30頁。1.3液-液萃取其他操作因素的控制液-液萃取并不能對(duì)所有的化合物。強(qiáng)極性化合物取得良好的萃取，如有機(jī)酸或有機(jī)堿，可以在水相中加入適當(dāng)?shù)姆措姾呻x子對(duì)試劑，達(dá)到液-液萃取強(qiáng)有機(jī)酸或有機(jī)堿的目的，又如金屬離子，通過在水相中加入鰲和劑與金屬離子形成疏水性的絡(luò)合物達(dá)到萃取金屬離子的效果。奄劉增蘇潮椅種漿癰標(biāo)柄鵝扒票何漲磷齊來溺俘鍘香榨晾甸桃囚鱗友窖假HPLC

14、樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第17頁，共30頁。（二）液-固萃取 液-液萃取有許多局限，如：需要大量互不相溶的溶劑；樣品處理步驟復(fù)雜；樣品回收率和重復(fù)性不理想；處理過程中乳狀液的生成；溶劑蒸發(fā)時(shí)，樣品降解所至的樣品損失。顧財(cái)壩提突釬隘本亂枉景條縱娟浸肋世慰試濱墑比沼壹?xì)J表嚇恭童攬輻劇HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第18頁，共30頁。液-固萃取方法采取高效、高選擇性的固定相，液-固萃取主要用于樣品分析前凈化和或富集，凈化操作是樣品分析中最重要的步驟之一。因?yàn)樵谔崛〔僮髦?，提取物中既有被測(cè) 成份又有別的干擾物或共萃物。這些物質(zhì) 可由下列化合物組成：探發(fā)性物質(zhì)、胺類、 酚類、

15、有機(jī)酸類糖類、油脂、葉綠素和其 他有色物質(zhì)等。銀踞褲樹滅禍禱炙效瘋肇踴斥葡典題郴啤恫怎迎進(jìn)蠢仗符默拓瀉暴輕蛋舞HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第19頁，共30頁。凈化方法中的一些問題提取液在凈化前，必須對(duì)待測(cè)化合物的一些重要的物理性質(zhì)有所了解，如在有機(jī)溶劑和水中的溶解性；酸性；穩(wěn)定性；蒸氣壓；熔點(diǎn)，沸點(diǎn)，極性。SEPPAK預(yù)處理柱-應(yīng)用于樣品的純化及痕量濃縮等方面。地瘍帖慧都翼胡剁為疾綱治沒支塹五咀醒魔投縮炙妄皚燥裕邑埔閃渴壯兵HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第20頁，共30頁。怒鑼締貫京慕尚蝸后惰誨予昂影私固遙載牧展欠疏掣迎酋帆埠呻衡審唯爪HPLC樣品前處理技術(shù)HPL

16、C樣品前處理技術(shù)第21頁，共30頁。窯鄰前囑蒸鼎鉑碎跨請(qǐng)傳蕾楷筋甩醚冠預(yù)謝迫怨棟粗銅綁芒么甄娠桿詢隔HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第22頁，共30頁。固相萃取的影響因素固相萃取一般有四個(gè)基本步驟： 固定相活化；樣品上柱；淋洗；分析物洗脫?；罨哪康氖莿?chuàng)造一個(gè)與樣品溶劑相溶的環(huán)境并除去柱內(nèi)所有的雜質(zhì)，通常需要兩種溶劑來完成，第一個(gè)溶劑（初溶劑）用于凈化固定相，第二個(gè)溶劑（終溶劑）用于建立一個(gè)合適的固定相環(huán)境使樣品分析物得到適當(dāng)?shù)谋Ａ?。每一活化溶劑用量約12ml/100mg固定相。擂興杠蜘赴蔭輾廟看蓄仆挨睡傈勃情不嗡位閱云鋅澗信狡槽腳鑒呻圍過豹HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理

17、技術(shù)第23頁，共30頁。除去雜質(zhì)的最好方法是用初溶劑洗柱，初溶劑應(yīng)該與洗脫溶劑一樣強(qiáng)或強(qiáng)與洗脫溶劑，這樣就可以除去所有可能與分析物一起洗出的物質(zhì)。終溶劑不應(yīng)強(qiáng)與樣品溶劑，若使用太強(qiáng)的溶劑，將降低回收率，通常采用的終溶劑要比樣品溶液弱。理想的終溶劑應(yīng)該與樣品溶劑性質(zhì)相似，例如，一個(gè)水樣被HCI調(diào)節(jié)到pH2，終溶劑（水）也應(yīng)用HCI調(diào)節(jié)到pH2。值得注意的是，在活化過程中和結(jié)束時(shí)，固定相都不能抽干，因?yàn)檫@樣可導(dǎo)致填料床出現(xiàn)裂縫，使回收率降低、重復(fù)性差，樣品也沒有得到應(yīng)有的凈化，如果在活化步驟中出現(xiàn)干裂，所有的活化步驟都得重復(fù)。仟羞氓搏蝗園梳速艦蛇丙肋諸宣釀而句味寒約靳進(jìn)卯基嘲檀矯糙水宿躬人HPLC

18、樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第24頁，共30頁。淋洗分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的樣品組分;淋洗溶劑的洗脫強(qiáng)度是略強(qiáng)于或等于上樣溶劑，淋洗溶劑必須盡量地弱，以洗掉多的干擾組分，但不能強(qiáng)到可以把所有分析物都洗掉的程度;溶劑的體積為0.5-0.8mL/100mg固定相，淋洗步驟也能確保粘壁在樣品都進(jìn)入固定相。 糊續(xù)脹醬綽吉上奉膨伊殆恰十片糧卜襟氏攪佰蜒楚柄直煮疵構(gòu)嬌快弘緣悟HPLC樣品前處理技術(shù)HPLC樣品前處理技術(shù)第25頁，共30頁。 洗脫淋洗后再將分析物從固定相上洗脫下來。洗脫溶劑的體積為0.5-0.8mL/100mg固定相，溶劑必須認(rèn)真選擇。溶劑太強(qiáng)，一些不要的組分將被洗出來，溶劑太弱，就需要更多的洗脫液。在溶劑選擇上還有幾點(diǎn)值得注意，有時(shí)在上樣、淋洗和洗脫時(shí)一個(gè)溶劑太強(qiáng)，另一個(gè)溶劑太弱，可以把兩者混合，通過改變它們的比例來滿足要求。另一值得注意的問題是溶劑的互溶性，后一種流過柱床的溶劑必須與前一溶劑互溶。有時(shí)候固體樣品必須用一個(gè)很強(qiáng)的溶劑萃取，這樣的萃取液是不能直接上樣，所以萃取液要