叔丁基對(duì)苯二酚及其氧化產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用

1、叔丁基對(duì)苯二酚及其氧化產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用李軍 畢艷蘭 孫尚德 丁一冉（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）摘要 采用紫外吸收光譜和熒光光譜法研究叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）及其氧化產(chǎn)物叔丁基對(duì)苯二醌（TQ）與牛血清蛋白（BSA）的結(jié)合作用。結(jié)果表明，TBHQ和TQ與BSA之間發(fā)生了相互作用并形成新的聚合體；TBHQ和TQ與BSA的熒光猝滅均屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。TBHQ和TQ與BSA之間的結(jié)合常數(shù)均大于104 L/mol，表明它們之間形成的配合物結(jié)合較為牢固；TBHQ和TQ與BSA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均為1；通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)方程計(jì)算得出：H0和G0.98，由此表明在這一系列濃度下存在

2、單一的猝滅機(jī)制，即靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅8。表1 不同溫度下TBHQ/TQ與BSA相互作用的Stern-Vorlmer曲線方程和相關(guān)系數(shù)T/BSA-TBHQBSA-TQ回歸方程R回歸方程R15y=0.251 4CTBHQ+0.999 70.993 1y=0.273 7CTQ+1.002 50.990 025y=0.205 6CTBHQ+0.998 00.995 5y=0.211 5CTQ+0.998 50.996 637y=0.177 3CTBHQ+0.996 80.980 8y=0.170 5CTQ+0.997 70.989 8動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅可以溫度來(lái)區(qū)分9。動(dòng)態(tài)猝滅由于與擴(kuò)散有關(guān)，當(dāng)溫度升

3、高時(shí)溶液的黏度下降，同時(shí)分子的運(yùn)動(dòng)加速，其結(jié)果將使分子的擴(kuò)散系數(shù)增大，從而增大分子猝滅常數(shù)。反之，溫度升高可能引起配合物穩(wěn)定性的下降，靜態(tài)猝滅常數(shù)減小。根據(jù)表1中BSA-TBHQ和BSA-TQ三個(gè)體系在不同溫度下的Stern-Vorlmer曲線方程的斜率和截距算出三個(gè)體系在在不同溫度下的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)果如表2所示。表2 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（Ksv）、猝滅速率常數(shù)（Kq）T/BSA-TBHQBSA-TQKsv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）Ksv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）1

4、52.514.052.744.41252.063.322.123.41371.782.861.712.75由表2可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ三個(gè)體系的Ksv均隨著溫度的升高而減小，表明BSA與TBHQ及BSA與TQ的反應(yīng)過(guò)程都是靜態(tài)猝滅過(guò)程。另外，由表2也可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系的猝滅速率常數(shù)Kq的值約為1011 Lmol-1s-1。由于各種熒光猝滅劑對(duì)于生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)Kq約為1010 Lmol-1s-110。顯然，BSA與TBHQ、TQ作用引起的猝滅常數(shù)大于最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)。進(jìn)一步表明BSA與TBHQ、TQ反應(yīng)的猝滅過(guò)程不是由動(dòng)態(tài)

5、碰撞引起的，而是因?yàn)樗鼈冎g通過(guò)靜態(tài)結(jié)合形成配合物產(chǎn)生的。2.3.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)對(duì)于靜態(tài)猝滅過(guò)程，如果生物分子中存在相似的和獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則結(jié)合常數(shù)（Kb）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）可根據(jù)方程（2）求得。 （2）其中，Kb是TBHQ/TQ與蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)，n是每個(gè)蛋白分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。根據(jù)方程（2）做log（F0/F-1）對(duì)logQ的雙對(duì)數(shù)回歸曲線，相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示。表3 BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的雙對(duì)數(shù)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、結(jié)合常數(shù)（Kb）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）體系T/回歸方程RKb104/（L/mol）nBSA-TBHQ15y=1.168 0CTBHQ+4

6、.208 10.992 31.611.1725y=1.179 1CTBHQ+4.137 70.996 81.371.1837y=1.187 3CTBHQ+4.065 90.988 91.161.19BSA-TQ15y=1.071 9CTQ+3.821 80.972 50.661.0725y=1.086 1CTQ+3.710 50.996 50.511.0937y=1.107 0CTQ+3.683 10.979 90.481.11由表3可以看出，BSA-TBHQ、BSA-TQ三個(gè)體系不同溫度下log（F0-F0/F）對(duì)logQ所做雙對(duì)數(shù)回歸曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.98，表明方程（2）的假設(shè)是正確

7、的；在實(shí)驗(yàn)溫度下n的值約為1，表明BSA與TBHQ、TQ的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均僅有1個(gè)；結(jié)合常數(shù)約為104 L/mol，說(shuō)明BSA與TBHQ、TQ之間的結(jié)合較為牢固。BSA的主要結(jié)合區(qū)域位于具有相似化學(xué)性質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)域IIA（Sudlows Site I）和IIIA（Sudlows Site II）的疏水腔中。因此，TBHQ和TQ最可能與區(qū)域A的疏水性空腔相結(jié)合，即212位色氨酸所在的結(jié)合位點(diǎn)附近。2.3.3 TBHQ、TQ與BSA的結(jié)合方式一般情況下，小分子與生物分子之間的相互作用力有疏水作用力、靜電作用力、范德華作用力和氫鍵11。為了闡明TBHQ、TQ與BSA之間的相互作用，以lnKb對(duì)1/T進(jìn)行線

8、性擬合，根據(jù)熱力學(xué)方程（3）、（4）計(jì)算其相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)如焓變（H）、熵變（S）和自由能變（G），結(jié)果如表4所示。 （3） （4）其中，Kb表示相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)。如果溫度變化不明顯，H可視為常數(shù)。表4 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的熱力學(xué)參數(shù)T/BSA-TBHQBSA-TQG/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）G/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）15-23.19-11.04+42.22-20.98-10.64+35.9025-23.62-11.04+42.22-21.34-10.64+35.9037-

9、24.12-11.04+42.22-21.77-10.64+35.90由表4中H、S值可得出TBHQ、TQ與生物分子BSA之間相互作用的結(jié)合方式：（1）S0表明了疏水作用力的存在，這是因?yàn)樗肿釉赥BHQ、TQ周?chē)帕杏行?，蛋白質(zhì)獲得了一個(gè)隨機(jī)結(jié)構(gòu)。（2）H0且不接近于0表明主要作用力不可能是靜電作用力。當(dāng)有氫鍵結(jié)合時(shí)，H0。因此，TBHQ、TQ與BSA相互作用的主要作用力是疏水作用力與氫鍵。并且由G0可以得知此反應(yīng)過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的。2.3.4 TBHQ和TQ與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移根據(jù)Foster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)能夠發(fā)射熒光的供能體與受能體之間的最大距離不超過(guò)7 nm，且供能體

10、的熒光發(fā)射光譜與受能體的紫外吸收光譜有足夠的重疊時(shí)，將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，從而導(dǎo)致熒光體發(fā)生熒光猝滅3。圖5 TBHQ/TQ的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜疊加圖從圖5中可以看出，TBHQ和TQ的紫外吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜均有一定程度的重疊，因此，根據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論公式（5）、（6）、（7）可求得TBHQ和TQ與BSA的結(jié)合距離r0，即能量轉(zhuǎn)移的距離。 （5） （6） （7）其中，E為能量轉(zhuǎn)移效率，R0為轉(zhuǎn)換能量效率取50%時(shí)的臨界距離，r0為能量轉(zhuǎn)移的實(shí)際距離，K2為偶極空間取向因子，通常取平均值2/3，為沒(méi)有能量轉(zhuǎn)移時(shí)供能體的熒光量子產(chǎn)率，通常蛋白質(zhì)中取色氨酸的量子產(chǎn)率0.11

11、8，n為介質(zhì)的折射率，通常取水和有機(jī)物折射率的平均值1.336，J為供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊，F(xiàn)()為波長(zhǎng)從到范圍內(nèi)經(jīng)過(guò)矯正的供能體的熒光強(qiáng)度，為波長(zhǎng)為時(shí)受能體的吸光系數(shù)。通過(guò)對(duì)波長(zhǎng)在300到450 nm范圍內(nèi)供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊部分進(jìn)行積分，求得BSA-TBHQ體系中J為8.9210-16 cm3L/mol，進(jìn)一步求得E為0.02 nm，R0為1.64 nm，r0為3.13 nm，這與Shahabadi等3的研究結(jié)果是一致的。同理，求得BSA-TQ體系中J為2.5310-15 cm3L/mol，進(jìn)一步求得E為0.02 nm，R0為1.95

12、nm，r0為3.73 nm。顯然，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系中供能體與受能體的結(jié)合距離r均7 nm，由此表明BSA到TBHQ和TQ均以能量轉(zhuǎn)移的方式與BSA之間發(fā)生了相互作用。2.4 構(gòu)象變化2.4.1 紫外吸收光譜紫外可見(jiàn)吸收光譜對(duì)于檢測(cè)絡(luò)合物的形成是一種簡(jiǎn)單而有效的方法。在本研究中，以BSA溶液為參比，通過(guò)加入不同量的TBHQ、TQ到BSA溶液中，來(lái)探索BSA的結(jié)構(gòu)變化（圖6）。圖6 不同溫度下BSA與不同濃度TBHQ/TQ作用的紫外吸收光譜（以25為例）注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ/TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75,

13、 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.從圖6可以看出，BSA的紫外吸收強(qiáng)度隨著TBHQ、TQ濃度的增加而增加，且擬合曲線的線性關(guān)系較好，這表明BSA與TBHQ、TQ之間形成了結(jié)合較好的復(fù)合物6。另外，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系紫外吸收光譜的最大吸收峰均發(fā)生紅移，進(jìn)一步說(shuō)明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變。2.4.2 同步熒光同步熒光光譜因具有簡(jiǎn)化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)而常用來(lái)探討蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，近年來(lái)越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用在小分子和生物大分子之間相互作用的研究領(lǐng)域中。對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光，=15 nm時(shí)僅表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光，=60 nm時(shí)僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒

14、光，因?yàn)椴煌被釟埢淖畲蟀l(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，所以可以根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng)的改變判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。圖7 BSA與不同濃度TBHQ作用的同步熒光光譜注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.圖8 BSA與不同濃度TQ作用的同步熒光光譜注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.如圖7、8所示，隨著TBHQ和TQ的添加

15、，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時(shí)被猝滅，且色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度隨TBHQ和TQ添加而降低的程度明顯快于酪氨酸殘基，表明TBHQ和TQ與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸3。另外，TQ對(duì)色氨酸殘基的熒光猝滅比TBHQ更明顯，表明TQ更容易跟BSA結(jié)合。對(duì)于TQ，色氨酸和酪氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)均發(fā)生了微弱的藍(lán)移，表明TQ的加入使BSA中這兩種熒光發(fā)射基團(tuán)附近的極性降低，疏水環(huán)境增強(qiáng)，說(shuō)明構(gòu)象發(fā)生了變化12；TBHQ在色氨酸最大波長(zhǎng)處發(fā)生藍(lán)移，在酪氨酸最大波長(zhǎng)處發(fā)生紅移，表明TBHQ和BSA的相互作用改變了色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的構(gòu)象，使色氨酸殘基基團(tuán)附近的極性降低、疏水環(huán)境增強(qiáng)，酪氨酸殘基集團(tuán)附近的極性

16、增強(qiáng)、疏水環(huán)境減弱。3 結(jié)論采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法研究了TBHQ和TQ與BSA的作用機(jī)制，TBHQ和TQ對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅，它們分別與BSA以1: 1的結(jié)合方式形成復(fù)合物；TBHQ和TQ與BSA的相互作用力以疏水作用力和氫鍵為主；紫外吸收光譜和同步熒光光譜表明TBHQ和TQ的加入，使得BSA在微環(huán)境中的極性發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生了變化。參考文獻(xiàn)1 李軍, 畢艷蘭, 楊會(huì)芳, 等. 加熱條件下大豆油中TBHQ的揮發(fā)、轉(zhuǎn)化規(guī)律及其對(duì)大豆油品質(zhì)的影響J. 食品科學(xué), 2014, 35(14): 106-112LI JUN, BI Yan-lan, YANG Hui-

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