病毒的鑒定方法

1、病毒的鑒定方法病毒的鑒定鑒定依據(jù)病毒分類鑒定方法病毒鑒定依據(jù)隨著現(xiàn)代病毒學(xué)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展歷程，病毒的檢測(cè)手段和方法也在不斷發(fā)展和改進(jìn)，但無(wú)論是什么樣的方法，都是根據(jù)病毒所共有的兩個(gè)特性而發(fā)展起來(lái)的。一是病毒的侵染性；二是病毒作為核蛋白的特性，也就是病毒理化性質(zhì)。病毒鑒定分類動(dòng)物病毒植物病毒噬菌體病毒其他鑒定方法植物病毒動(dòng)物病毒噬菌體病毒其他鑒定法Part1 植物病毒枯斑和指示植物檢測(cè)法 血清學(xué)檢測(cè)法酶標(biāo)免疫吸附法(ELISA) 電鏡負(fù)染檢測(cè)法 電鏡超薄切片法 基因檢測(cè)技術(shù) 免疫電鏡檢測(cè)法1.枯斑和指示植物檢測(cè)法植物病毒最方便的測(cè)定法是利用受病毒侵染能產(chǎn)生枯斑的寄主植物進(jìn)行檢測(cè)病毒，此法是美國(guó)

2、病毒學(xué)家霍姆斯(Hohnes)在1929年發(fā)現(xiàn)的，用感病的植物葉片與少許金剛砂相混，研磨成粗汁液，然后在指示植物的葉片上蘸取汁液，磨擦供試植物的葉片，經(jīng)清水清洗后，置于室溫條件下的溫室內(nèi)待測(cè)，2-3d后葉片上會(huì)出現(xiàn)局部壞死灶，即圓形的枯斑，在一定的范圍內(nèi)，枯斑數(shù)與侵染性病毒的濃度成正比?？莅叻m不能測(cè)出病毒總的核蛋白濃度，但能測(cè)出病毒的相對(duì)侵染力，對(duì)于病毒的定性有著重要的意義。諾貝爾獎(jiǎng)獲得者美國(guó)科學(xué)家斯坦利(Stanley)第一次提純出TMV(煙草花葉病毒)時(shí)就是使用此法來(lái)檢測(cè)病毒的。時(shí)至今日，很多試驗(yàn)室和生產(chǎn)檢測(cè)單位仍然利用此方法檢測(cè)病毒。枯斑法在提純一個(gè)未知病毒時(shí)，它還可起到追蹤病毒蹤跡的

3、作用，一旦有了病毒的純品，利用病毒的稀釋曲線，可以換算出病毒的實(shí)際濃度。2.血清學(xué)檢測(cè)法基本原理是動(dòng)物受其致病細(xì)菌、病毒侵染后，動(dòng)物體內(nèi)血液中的球蛋白發(fā)生變化而產(chǎn)生抗體，引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體的物質(zhì)簡(jiǎn)稱為抗血清。血清中的抗體能與同系的抗原在體外特異的結(jié)合，這一特性就是血清學(xué)測(cè)定病毒的基本原理。這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病毒的定性定量分析和醫(yī)學(xué)臨床診斷上，其方法的種類也很多，這里僅對(duì)一些重要的方法做扼要的介紹：(2)沉淀法。相對(duì)來(lái)說(shuō)沉淀法即非常簡(jiǎn)便，在植物病毒學(xué)中應(yīng)用的極為廣泛，其原理是在電解質(zhì)存在時(shí)，抗體與同源抗原相互結(jié)合形成沉淀，不同病毒類型所形成的沉淀也不同。如桿狀、線狀病毒形成絮狀沉淀，球形病

4、毒多形成顆粒狀沉淀，通過(guò)稀釋終點(diǎn)法，就是利用抗原稀釋終點(diǎn)對(duì)于每種病毒來(lái)說(shuō)是比較穩(wěn)定的這一特點(diǎn)，來(lái)測(cè)試病毒的濃度。(1)補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法。血清中有一種對(duì)熱不穩(wěn)定的成分，它能在抗體存在的條件下，溶解紅血球或破壞革蘭氏陰性菌，這種成分就稱之為補(bǔ)體。補(bǔ)體是一種很復(fù)雜具有酶活性的蛋白質(zhì)，在560(；下加熱，30min后補(bǔ)體則失活，它的一個(gè)重要特性是一旦抗體與抗原結(jié)合，則補(bǔ)體也與之結(jié)合，通過(guò)補(bǔ)體的酶作用可以溶解紅細(xì)胞。3.酶標(biāo)免疫吸附法(ELISA)Elisa方法是Enzyme-Linked immunosorbentassay的縮寫，最早用于動(dòng)物病毒的檢測(cè)，近二三十年才應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)，并作為病毒的定

5、量方法廣泛應(yīng)用于病理、免疫學(xué)的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，對(duì)病毒進(jìn)行快速檢測(cè)。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，能與放射免疫技術(shù)媲美。有很多的病毒因其濃度太低或某種抑制劑的干擾，常規(guī)血清學(xué)方法檢測(cè)不出時(shí)，此法就顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性。該方法首先將同源特異抗體吸附在反應(yīng)器皿底部，加入欲測(cè)試的含病毒的樣品，病毒與抗體結(jié)合，病毒顆粒被固定，再加入酶標(biāo)記的特異抗體和酶的底物，酶與底物反應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)有顏色的溶液其強(qiáng)度與病毒濃度成正比，用此方法可測(cè)定出病毒的濃度。4.電鏡負(fù)染檢測(cè)法第一臺(tái)電子顯微鏡的誕生打開了人類認(rèn)識(shí)微觀世界的大門，電鏡技術(shù)在近70年發(fā)展歷程中，為生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)。正是由于電鏡的出現(xiàn)

6、，實(shí)現(xiàn)了人類可直觀病毒及其他生物大分子的可能。因此電子顯微鏡技術(shù)可以說(shuō)是最直接，最準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒的手段，它可以直接看到病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、存在與否，所以在進(jìn)入了分子水平的今天它仍然有著不可替代的作用。電鏡負(fù)染技術(shù)是20世紀(jì)60年代開始使用于英國(guó)試驗(yàn)室，當(dāng)時(shí)人們發(fā)現(xiàn)一些重金屬離子能繞核蛋白體四周沉淀下來(lái)，形成一個(gè)黑暗的背景，在核蛋白體內(nèi)部不能沉積而形成一個(gè)清晰的亮區(qū)，其圖像如同一張照相的底片，因此人們習(xí)慣地稱為負(fù)染色，電鏡負(fù)染技術(shù)也就由此而生。5.免疫電鏡檢測(cè)法免疫電鏡技術(shù)是將免疫學(xué)原理與電鏡負(fù)染技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，在電鏡制樣過(guò)程中，病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內(nèi)，而容易造成電鏡觀察時(shí)的疏漏

7、，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附性的這一特點(diǎn)，在電鏡制樣過(guò)程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細(xì)胞色素A，稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點(diǎn)上一滴抗原和染液，由于細(xì)胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成均勻的涂層，再加抗體、抗原的吸附作用使病毒能較集中地沉集在有效視野內(nèi)，從而便于電鏡下的觀察，大大提高了檢測(cè)幾率。6.電鏡超薄切片法該技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)達(dá)到病毒的體內(nèi)定位研究和體內(nèi)復(fù)制及侵染過(guò)程的動(dòng)態(tài)研究水平，并能直觀病毒生物大分子的亞基單位，已經(jīng)從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平。尤其對(duì)一些未知病毒，難于提純的病毒材料，負(fù)染技術(shù)不能解決的檢測(cè)材料都可用此方法，通過(guò)對(duì)組織細(xì)胞的直接觀

8、察而得到解決，因此在病毒學(xué)檢測(cè)和脫毒快繁的實(shí)際生產(chǎn)中均有著特殊的重要性和不可取代的作用。7.基因檢測(cè)技術(shù)基因工程技術(shù)的興起在對(duì)病毒的檢測(cè)手段中帶來(lái)了新的飛躍，檢測(cè)水平已經(jīng)達(dá)到超微量，即微克水平。其成熟的方法也很多，如分子探針雜交檢測(cè)技術(shù)，利用一定序列的核苷酸合成探針，通過(guò)分子雜交技術(shù)，檢測(cè)出供試樣品中與之相補(bǔ)的堿基序列。PCR技術(shù)是通過(guò)體外擴(kuò)增可以使供試樣品中的目的基因片段很快擴(kuò)增，使之達(dá)到了對(duì)即使是病毒含量極低的樣品，也能靈敏準(zhǔn)確地得到定性的結(jié)果?；驒z測(cè)技術(shù)對(duì)病毒的檢測(cè)已經(jīng)達(dá)到分子水平，其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測(cè)所不能比擬的，同時(shí)可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。Part2

9、 動(dòng)物病毒細(xì)胞病變效應(yīng) 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定 蝕斑和感染病灶 血凝現(xiàn)象和干擾現(xiàn)象1.細(xì)胞病變效應(yīng) 細(xì)胞變化，由病毒引起的細(xì)胞病變稱為細(xì)胞病變效應(yīng)，不同病毒有不同的病變效應(yīng)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本一般以細(xì)胞病變效應(yīng)作為病毒感染的指標(biāo)2.包含體包含體是某些病毒增殖過(guò)程中在宿主細(xì)胞內(nèi)形成的嗜酸性或嗜堿性的病變結(jié)構(gòu)。由于不同病毒包含體的大小、形狀、組分 以及存在于宿主細(xì)胞中的部位均不同，所以包含體可用于病毒的分類、快速鑒別和某些病毒疾病的輔助診斷指標(biāo)。例如，昆蟲病毒可根據(jù)包含體的特性及有無(wú)分為質(zhì)型包含體病毒、核型包含體病毒、顆粒體病毒及無(wú)包含體

10、病毒4類；煙草花葉病毒與馬鈴薯Y病毒的形態(tài)及其相似，但它們的包含體形態(tài)截然不同，前者為三角形，后者為矩形；狂犬病毒可在神經(jīng)元細(xì)胞中形成特征性的嗜酸性包含體，又稱內(nèi)基氏小體，具有診斷價(jià)值。1.細(xì)胞融合現(xiàn)象指由于病毒感染宿主細(xì)胞而出現(xiàn)的多核細(xì)胞現(xiàn)象。其發(fā)生決定于病毒和細(xì)胞的種類，也受病毒數(shù)量、溫度、離子強(qiáng)度等因素的影響。如豬腎繼代細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞融合，但不能在人的二倍體成纖維細(xì)胞中誘發(fā)融合現(xiàn)象。2.紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的

11、發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。3. 50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定 本法可估計(jì)所含病毒的感染量。方法是測(cè)定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。4.蝕斑和感染病灶 一些動(dòng)物病毒在動(dòng)物細(xì)胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，由于受病

12、毒感染細(xì)胞裂解，出現(xiàn)與噬菌斑類似的蝕斑或稱空斑。5.血凝現(xiàn)象和干擾現(xiàn)象 血凝現(xiàn)象指帶有血凝素的病毒能凝聚一定種類哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞。如流感病毒、天花病毒。可根據(jù)病毒凝聚的血細(xì)胞種類及凝聚條件不同而鑒定病毒。 干擾現(xiàn)象指兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，一種病毒抑制另一種病毒增殖的現(xiàn)象。如乙型腦炎病毒能干擾脊髓灰質(zhì)炎病毒，流感病毒可干擾西方型馬腦炎病毒的增殖等。若在某一組織細(xì)胞培養(yǎng)物同時(shí)加入接種物及可被干擾的病毒，若后者被抑制，則可間接判斷接種物存在可干擾后者的病毒。噬菌體病毒雙層平板法 菌體的噬菌斑測(cè)定一般采用雙層平板法，將一定量經(jīng)稀釋的噬菌體懸液與高濃度敏感菌懸液及半固體瓊脂培

13、養(yǎng)基（1%瓊脂）混合均勻，倒入含底層瓊脂培養(yǎng)基（2%瓊脂）9的平板，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后，在細(xì)菌菌苔上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)個(gè)圓形局部透明區(qū)域，即噬菌斑?？梢哉J(rèn)為，每個(gè)噬菌斑是一個(gè)噬菌體侵染的結(jié)果，一個(gè)噬菌斑中的噬菌體遺傳性都相同，故通過(guò)多次重復(fù)接種，可獲得純系噬菌體。因每種噬菌體的噬菌斑有一定大小、形狀、邊緣和透明度，故可以作為鑒定的指標(biāo)。此外，噬菌斑亦可用于病毒的定量。Part3 噬菌體病毒Part4 其他鑒定方法免疫熒光（IF）法 病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察法血清學(xué)鑒定法 電噴方法 1.免疫熒光（IF）法 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，

14、普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測(cè)性診斷。免疫熒光（IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。2.病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察法 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。 3.血清學(xué)鑒定法 用已知的診斷血清來(lái)鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，