細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法

1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法一、細(xì)胞計(jì)數(shù)這是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為細(xì)胞計(jì)數(shù)板。巴氏吸管和顯微鏡。 步驟如下。l取清潔計(jì)數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕擦干。l取細(xì)胞懸液0.3ml，加入0.9結(jié)晶紫染液，混勻后滴半滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢為宜。也可直接將細(xì)胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過(guò)少或 出現(xiàn)氣泡。l在顯微鏡下用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。代入下式得出細(xì)胞密度。細(xì)胞數(shù)（ml） = （4大格細(xì)胞數(shù)之和/4）X104X稀釋倍數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法可計(jì)算出活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)以測(cè)定細(xì)胞存活百分率。一般0.5%-1.0% 的臺(tái)盼藍(lán)染液可使死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不

2、著色。此外還可用0.02%的藻紅b染液將死細(xì) 胞或受損細(xì)胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細(xì)胞染成黑絲。細(xì)胞存活率=4大格活細(xì)胞數(shù)/ （4大格活細(xì)胞數(shù)+4大格死細(xì)胞數(shù)）X100%在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)操作時(shí)，必須把細(xì)胞懸液準(zhǔn)備好，細(xì)胞應(yīng)分散良好，并充分混勻， 若出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10mm2或多于500個(gè)/100mm2時(shí)，需重制細(xì)胞懸液，重 新計(jì)數(shù)。二、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)倍數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本的指標(biāo)，是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)增值數(shù)值和生長(zhǎng)繁 殖基本規(guī)律常用的簡(jiǎn)便方法。常用的方法為：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種等量的同一代細(xì) 胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24h取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)

3、時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)的 對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，標(biāo)出各點(diǎn)并連成線，即為該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，可反映出細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)。測(cè)定生長(zhǎng)曲線的另一種方法是用96孔/24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)1周 （7天），期間逐日檢測(cè)一組，計(jì)數(shù)，最后把7天中的細(xì)胞數(shù)值繪成圖，即為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。也可采用MTT法來(lái)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，經(jīng)過(guò)一 段時(shí)間的潛伏期，再進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到平臺(tái)期后生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后衰老。細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)是指測(cè)定接種時(shí)活細(xì)胞的濃度，經(jīng)1個(gè)生長(zhǎng)周期達(dá)到最大活細(xì)胞濃度比例。生長(zhǎng)倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細(xì)胞數(shù)濃度/接種時(shí)的活細(xì)胞濃度三、細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)

4、胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)。它以被測(cè)的1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì) 胞數(shù)來(lái)計(jì)算。其方法為：用秋水仙素將細(xì)胞處理1-2h后，玩染色制片法制片并染色，計(jì)算 1000個(gè)細(xì)胞中分裂象的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。l細(xì)胞準(zhǔn)備。用支持物蓋片培養(yǎng)法。l每24h取出一個(gè)小蓋片，按常規(guī)方法進(jìn)行固定，吉姆薩染色或HE染色，封片，制成永久標(biāo)本。l顯微鏡下選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞并計(jì)數(shù)。逐個(gè)視野進(jìn)行，對(duì)每一時(shí)間組的蓋片各取細(xì)胞多、中、少的區(qū)域各一個(gè)，共計(jì)算000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出平 均分裂細(xì)胞所占百分比。觀察時(shí)要掌握好分裂象標(biāo)準(zhǔn)，主要是確定好劃分間期和前期，末期 和間期等的界限，以減少誤差。細(xì)

5、胞分裂指數(shù)二分裂細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)（1000）X1000 next四、細(xì)胞接種存活率細(xì)胞接種存活率又稱細(xì)胞貼壁率。它是下?lián)鼙恢瞥煞稚⒌膽乙汉?，以低濃度?-5 個(gè)/cm2）接種到底物上，貼壁并能存活生長(zhǎng)形成細(xì)胞小群（克?。┑募?xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表 示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。l取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線接種細(xì)胞的原則，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，接種12-15瓶。l每2h取出一瓶，倒掉培養(yǎng)科，然后加入胰酶消化已貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)已貼壁細(xì)胞，用下面的公式逐個(gè)計(jì)算每個(gè)時(shí)間上的貼壁率。每2h一次，共觀察24h即12次。接種存活率（貼壁率）=（貼壁村活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X

6、 100%五、克隆形成率細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能 增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增值活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群 體依賴性和增值能力兩個(gè)重要性狀，由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大， 一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率低，傳代細(xì)胞系高；二倍體細(xì)胞克隆形成率低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系高；正常細(xì)胞克隆形成率低，腫瘤細(xì)胞高。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成 率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在皿中，持續(xù)1周，隨時(shí)檢查，到 細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。1、平板克隆形成試驗(yàn)l取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋

7、白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中備用。l將細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿中。一般按每皿50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度接種于含10ml 37C預(yù)溫培養(yǎng)基的皿中，并輕轉(zhuǎn) 動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置于37C、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2-3周。l經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或醋酸/甲醇（1： 3） 5ml，固定15min。然后去固定液，加適 量吉姆薩應(yīng)用染液染10-30min，然后用流水緩慢洗去染液，空氣干燥。l將培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼

8、直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆。最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞）X100%平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料的 瓶。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)， 接種密度不能過(guò)大。2、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)l取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1X106個(gè)/L。然后根據(jù) 試驗(yàn)要求做梯度倍數(shù)稀釋。l用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低熔點(diǎn)軟瓊脂，高壓滅菌后，維持在40 C中不會(huì)凝固。l按1： 1比例讓1.2%的瓊脂糖液和2XDMEM培養(yǎng)基混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中，冷卻凝固作為底層瓊脂，置CO2恒溫箱中備用。l按1： 1比例讓0.7%瓊脂糖液和2XDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層的平皿中，逐漸形成雙瓊 脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)10-14天。把平皿放