細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

1、細(xì)胞的凍存細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在一70C以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于 完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)）20C階段的處理過(guò)程。在 此溫度范圍內(nèi)，水品呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷?？偟脑瓌t是緩慢凍存！ ！ 一材料：生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基，DMSO,無(wú)菌塑料冷凍保存管，血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片。二步驟：2.1冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形，最好細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMS0加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10%，混合 均勻，置于室溫下待用。避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收

2、集培養(yǎng)之細(xì)胞與凍存管內(nèi)，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1 mL）計(jì)數(shù) 細(xì)胞濃度。先將凍存管放入4二冰箱，約40min。2.5接著置于-20C冰箱，約30-60min。20 C不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰品過(guò)大，造成細(xì)胞 大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放A-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。2.8同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。三注意事項(xiàng)：使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞它的 分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手 套操作?；旌螪MSO要快

3、，因?yàn)镈MSO對(duì)細(xì)胞有毒性，混合之后應(yīng)盡快凍存，提醒各位注意的 是加入凍存液后一定要混勻，防止DMSO沉淀。凍存液比例：培養(yǎng)基7：血清2： DMSO1，也 有將血清比例加大的做法，有的甚至將血清提高到90%，具體濃度視經(jīng)驗(yàn)而定，但是好多人認(rèn) 為小牛血清含量越高越好！不宜將凍存細(xì)胞放置在0C-60C這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū) 內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”?？梢韵仍谂菽洗蚩?，把凍存管塞進(jìn)去。這樣降溫可以慢一點(diǎn)，當(dāng)然包上 棉花也是不錯(cuò)的主意。注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。3.4 -20 C不可超遏1小畤，以防止冰品遏大而造成名田胞大量死亡，亦可跳遏此步驟，冷7柬管 置於厚保履育

4、盲內(nèi)，直接放A-80C冰箱中，但存活率畬降低一些。但是大多數(shù)人：4度半小時(shí)， 一20度半小時(shí)，一80度過(guò)夜，液氮保存。3.5冷7柬管內(nèi)名田胞敷目一般至少舄10*6-7/mL以上，凍存細(xì)胞健康程度一般要求活細(xì)胞在95% 以上，細(xì)胞活力差的在凍存后的成活機(jī)率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時(shí)期凍存。3.6細(xì)胞凍存管一般有1.5-2mL左右體積，原則上可以存放1.5mL充滿均勻懸浮細(xì)胞的凍存液， 一些人喜歡灌注1-1.5mL凍存液凍存，這實(shí)際上并不好。原因如下：凍存液凍存需要一段時(shí)間， 如果這段時(shí)間凍存管傾斜，液體容易流到管口，很容易在后續(xù)的操作中造成污染。建議0.5-1mL 之間即可。但是還是用1

5、.5mL的話，具體操作時(shí)，凍存管直立起來(lái)放在-20的冰箱里，這樣不 容易造成污染。同時(shí)凍存細(xì)胞的時(shí)候，一定加上封口膜，這樣可以避免復(fù)蘇的時(shí)候，水浴箱里的水進(jìn)入蓋 子的縫隙中！凍存管外面用封口膜封上后，最好再用白膠布再封一下。這樣可以防止細(xì)胞復(fù)蘇 時(shí)，封口膜崩裂，水浴箱中的水進(jìn)入凍存管。3.7提醒：細(xì)胞凍存在-4度，或一20時(shí)就忘了，我干過(guò)好幾次這樣的事（這幾次細(xì)胞種很好， 很心疼），其實(shí)可以將凍存細(xì)胞時(shí)用厚厚的棉花把凍存管包起來(lái)，直接放進(jìn)一70度冰箱，復(fù)蘇 效果也不錯(cuò)。3.8注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色（以0.22 micronFGLP Telflon 過(guò)濾或是直接

6、購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650），以510 ml小體積分裝，4C避光保存，勿作 多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用， 因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng) 費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并 在細(xì)胞內(nèi)形成冰品。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰品；相反.結(jié)品就大，大結(jié)品 會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的

7、是防止小冰品形成大冰品，即冰 品的重結(jié)品。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25 C以上時(shí)，12 0min當(dāng)溫度達(dá)-25 0以下時(shí)，510 C/min當(dāng)溫度達(dá)-100C時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定 于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 C的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直 接投人液氮中。更簡(jiǎn)單的：也可以在凍存細(xì)胞時(shí)用厚厚的棉花把凍存管包起來(lái)，直接放進(jìn)一70度冰箱，復(fù)蘇效 果也不錯(cuò)。在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一 種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性

8、，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使 細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰品，減少胞內(nèi)冰品，從而減少冰品對(duì)細(xì)胞的損 傷。細(xì)胞凍存步驟1、 預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基、10% DMSO；冷凍保護(hù)劑濃度為5或10% DMSO， 若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失 敗。2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?，用吸管吹打制成?xì)胞懸液（1x1065 x106 細(xì)胞 /mL）；3、加入1mL細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。為了保證培養(yǎng)細(xì)胞系的 完整性，必須進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄，應(yīng)包括以下內(nèi)容：細(xì)胞系的種類及

9、來(lái)源、有無(wú)污染（如細(xì) 菌，病毒，支原體）、細(xì)胞代數(shù)和倍增時(shí)間、以及選擇性突變4年后，存活率可達(dá)80%90%。DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì) 胞。細(xì)胞復(fù)蘇方法1操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。2自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。 凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。冷凍管于放入和取出液氮桶 時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。3將新鮮培養(yǎng)基置于37C水槽中回溫，回溫后噴以70 %酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。 4取出冷凍管，立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，

10、以70 % ethanol擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。注意水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染5用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒 的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。取出0.9 mL解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例1:101:15），混合均勻，放 入。02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 mL解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。6解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或glycerol），依細(xì)胞種類而異，一般而言，大 都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之

11、細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 mL培 養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（一定要用這么多培養(yǎng)基清洗么，其他緩沖溶液是否可以呢？）細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5X105/mL為宜。將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 繼續(xù)培養(yǎng)。7若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。8細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生 單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）。細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞濃度應(yīng)該多少？normal human fibroblast: 13 x106 cells/mLhybrido

12、ma: 13 x 106 cells/ mL，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在 解凍24小時(shí)后死去。adherent tumor lines: 57 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而 HeLa 只需 1-3 x 106 cells/mL。other suspensions: 510 x 106 cells/mL, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/mL。冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為510 x106 cells/mL，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/mL為宜。Thawing of Cell

13、s / Initiation of Culture ProcessThe recommended seeding density for HMVEC-D, HMVEC-dLy, HMVEC-dBl, HMVEC-L, HMVEC-LLy, HMVEC-LBl, HMVEC-Bd, HMVEC-C and UtMVEC-Myo is 5,000 cells/cm2 and the recommended seeding density for HUVEC, HCAEC, HPAEC, HAEC, HIAEC, HUAEC, bAEC, bCAEC, and bPAEC is 2,500 to 5

14、,000 cells/cm2.To set up cultures calculate the number of vessels needed based on the recommended seeding density and the surface area of the vessels being used. Add the appropriate amount of medium to the vessels (1 ml/5 cm2 ) and allow the vessels to equilibrate in a 37 C, 5% CO2, humidified incub

15、ator for at least 30 minutes. Do not seed cells into a well plate directly out of cryopreservation.Wipe cryovial with ethanol or isopropanol before opening. In a sterile field, briefly twist the cap a quarter turn to relieve pressure, then retighten. Quickly thaw the cryovial in a 37 C water bath be

16、ing careful not to submerge the entire vial. Watch your cryovial closely; when the last sliver of ice melts remove it. Do not submerge it completely. Thawing the cells for longer than 2 minutes results in less than optimal results.Resuspend the cells in the cryovial and using a micropipette, dispense cells into the culture vessels set up earlier. Gently rock the culture vessel to evenly distribute