免疫組化及特殊染色

1、techniques第一節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)概述(-)發(fā)展簡史1941年Coons首先用熒光素標(biāo)記抗體檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功o60年代Nakane建立酶標(biāo)抗體技術(shù)運(yùn)用鐵蛋百標(biāo)記Ab技術(shù)70、80年代多位科學(xué)家改良上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)技術(shù)抗生物素一生物素(ABC)法使免疫組織化學(xué)進(jìn)入了應(yīng)用階段。O2000年以后各種免疫組化技術(shù)更加成熟,使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之(-)免疫組織化學(xué)的原理定義:是應(yīng)用基本原理一抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，

2、通過化學(xué)反應(yīng)使的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和)，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為(immunohistochemistry)或(immunocytochemistry)。將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記,在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性?？乖侵改軌虼碳ぎa(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。抗原的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)

3、物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性與人類有關(guān)的抗原病原微生物在醫(yī)療中將病原微生物制成疫苗進(jìn)行預(yù)防接獨(dú)，可以提高人的免疫力。嗜異性抗原一類與種屬特異性無關(guān)的、存在于人以及某些動物、擅物、微生物的性質(zhì)相同的抗原。腫瘤抗原由物理的、化學(xué)的因素或某些病毒誘發(fā)的實(shí)驗動物腫瘤.其細(xì)胞中或細(xì)胞表面均出現(xiàn)特異性抗原，稱為腫瘤特異性抗原。已證實(shí)在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關(guān)的抗原。同種異體抗原-動物免疫血清抗體(antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在刺激下，由B淋巴細(xì)胞或殖分化成的所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生結(jié)合的免疫球蛋白。世界著名抗體公司Santa公司、Abeam公司、Abgent公司、ProteintechGr

4、oupCellSignalingTechnology（CST）、羅氏公司（Roche）標(biāo)記物它借助于熒光素、酶等標(biāo)記抗體與組織切片或細(xì)胞涂片中相關(guān)抗原相結(jié)合，由于熒光素所發(fā)熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經(jīng)一定的顯色處理，呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，從而可準(zhǔn)確定位欲測定的抗原物質(zhì)。熒光素、酶I標(biāo)記抗體八Y組織抗原抗體:+酶熒光素抗原顯微鏡觀察基本原理三大系統(tǒng)本技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理來識別待測抗原，再通過酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應(yīng)顯示出來。識別系統(tǒng)聯(lián)結(jié)系統(tǒng)免疫組織化學(xué)顯示系統(tǒng)識別系統(tǒng)是指特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原?？乖贵w的特異性結(jié)合是本技術(shù)的基本依據(jù)O聯(lián)結(jié)系統(tǒng)由聯(lián)結(jié)抗體構(gòu)成。它的作用是聯(lián)

5、接識別系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)。顯示系統(tǒng)的目的是使抗原抗體間的特異性結(jié)合變?yōu)槿庋劭梢姟Ｒ虼孙@示系統(tǒng)由標(biāo)記酶9底物和顯色劑組底9以在靶抗原存在位點(diǎn)上形成有色沉淀。特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度咼定位準(zhǔn)確和簡便快速等優(yōu)點(diǎn)又能夠?qū)⑿螒B(tài)、功能及代謝的研究有機(jī)結(jié)合起來。三步1過去用過的方法O-法,橫用生楊素2目前最常用的方法（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTMplus檢測試劑盒）將多個抗鼠和抗兔的IgG分子二抗與殊根過氧化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)揍成一個大分子多聚體（polymer）,直接放大信號40-50倍。躺歟方便背景低（避免了內(nèi)源性生IHC方法3最幕一代的免疫組化NovoIinkPolymer法:使用

6、小分子聚合物（減少細(xì)胞薄膜硬脂的阻礙,簇豔的加翳翳讓爲(wèi)驢AASTEP3AAASTEP4AASTEPSIHC技術(shù)的基本操作流程EnliVision法的工作程序：切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APES）電勺處理（一阻斷內(nèi)源性過氧化物酶），蒸餡水漂洗組織切片的預(yù)處理（枸椽酸鈉緩沖液中熱修復(fù)，酶消化一暴露出抗原決定簇），TBS漂洗內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷一抗孵育,TBS漂洗二抗孵育,TBS漂洗DAB顯色，蒸館水中止反應(yīng)蘇木素復(fù)染及封片IHC染色結(jié)果的判讀原貝!|注意影響IHC結(jié)果判讀的因素玻片干燥造成I阻止內(nèi)源性過氧化物酶后假陽性假陰性：注意內(nèi)對照福爾馬林固定酒精固定n0UIS

7、U-丨0迅八丙-厶一亠K心-SCrAFPAFPHCGfactorW-RAprolactininEMA,immunoiinspecialconditionsactivatedpituicytechromograninAserotoninCytoskeletoNucleusDNApolymeraseEndocrinegranuleLysosomeMitochondoriaCytosolkeratininST00(occasional)carcinoid,:宓咋新PAcP卩keratinvimentinGFAPtubulinST00NSEprefixationestrogenreceptormeso

8、thelion?nocYcin?madiffusionvimentin.hepatocyteartifactact,n飢細(xì)胞膜陽性CD31、CD56等細(xì)晁粘附分子：E-cadherin、交聯(lián)膜蛋白分子：catenindystrophin等細(xì)胞表面受體：EGFR、c-erbB2c-kit/CD117（酪氨酸激酶受體）等絕大多數(shù)白細(xì)胞抗原：LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：V訂lin、BerEP4EMA、CEA、CA125、EBV-LMP1等I細(xì)胞軸胞周期素蛋白：cyclins、cyclin依賴激W(cdk)cdk抑制劑(如pl6)等細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白：Ki67、PCNA轉(zhuǎn)錄因子：M

9、yoDl、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5腫瘤抑制基因:如p53、p63、Rb、WT1基因錯配產(chǎn)物：如MLH1、MSH2細(xì)胞核酶：如TdT類固醇激素受體：如ER、PR、AR細(xì)胞核鈣結(jié)合蛋白：如S100蛋白、calretinin定位細(xì)胞核的病毒：如CMV、HBcAg（核+核周）NeuN：neuronalnuclei,表達(dá)于成熟的神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)顆粒狀陽性一定位于細(xì)胞器溶酶體顆粒！如lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小體和前黑色素小體：如HMB45、Melan-A細(xì)胞毒顆粒：如TIA-1、granzvmeB線粒體：如抗線粒體抗體，HEP-PAR1神經(jīng)內(nèi)分

10、泌顆粒：各種激素（如PTH、ACTH、insulin）、CgA、SvnW-P小體：F-VIII相關(guān)抗原分泌顆粒：女口BRST-2、surfactantsPSA細(xì)胞內(nèi)微生物：如弓形蟲漿纖維狀陽性一中間絲或微絲中間絲;CK;Vimentin;DesminGFAP（glialfibrillaryacidicprotein,膠質(zhì)纖維酸性蛋白）NF（Neurof訂ament,神經(jīng)元胞漿節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤，副節(jié)瘤/嗜輅細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤）Nestin：巢蛋白，神經(jīng)前體細(xì)胞巒漫或片狀的細(xì)胞漿陽性轟分布在細(xì)胞內(nèi)液、大量的微囊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中如:myoglobin、hemoglobinalbuminAFP、NSEcyto

11、plasmicIg、CD3病毒顆粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁著色）從細(xì)胞間液吸收的蛋白如：Igalbumin三）免疫組化的應(yīng)用分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷；證實(shí)內(nèi)分泌腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；應(yīng)用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（CEA）對胃腸道癌、甲胎蛋白（AFP）對肝癌和卵巢內(nèi)胚竇癌診斷有幫助；有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應(yīng)用免疫球蛋白輕鏈K和入來鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾泡性反應(yīng)性增生;研究某些癌癥與病毒的關(guān)系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與EB病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等的關(guān)系；為腫瘤治療的選擇提供依據(jù)，如乳腺癌檢測雌、孕激素受體（ER、PR）呈陽性時，應(yīng)用他莫昔芬（三苯氧胺）

12、治療可預(yù)期獲得較好的療效；檢測癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物（如c-erbB2,p53）、增生活性抗原（如Ki-67,PCNA）用來估計腫瘤的預(yù)后。免疫組化在臨床診斷中(應(yīng)用病例示范(Case1)協(xié)床病史資料:48歲，男性，胃活檢標(biāo)本取自胃大彎部位。H&E染色切片描述腫瘤細(xì)胞顯示在間質(zhì)中呈癌巢樣，鄰近的腺體腸上皮化生，間質(zhì)中的不規(guī)則的巢狀結(jié)構(gòu)待診斷.IFAif、bH址:染色首先選擇Cytokeratin單克隆廣譜角蛋白抗體在細(xì)胞巢中呈強(qiáng)陽性染色，證明是上皮來源性的腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺上皮陽性，腫瘤性的腺體在底部。腫瘤細(xì)胞再進(jìn)一步進(jìn)行cytokeratin7/cytokeratin20染色，

13、染色證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中同時缺少cytokeratin7/cytokeratin20的表達(dá)。在這張圖片中腸上皮細(xì)胞cytokeratin20陽性與鄰近商腫瘤細(xì)胞陰性形成明顯的對照。cytokeratin7and20在臨床中使用中,如果同時都不表達(dá)，特異性地表示麻瘤細(xì)胞為來源于一些上皮的腫瘤(subsetofepithelialtumors),包括腎細(xì)胞癌，前列腺癌、肝細(xì)胞癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等。Synaptophysin測定Synaptophysin所有腫瘤細(xì)胞中都顯示出較強(qiáng)的陽性表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中包繞的腸腺體呈陰性診斷:神經(jīng)內(nèi)分泌癌Ki-67測定:Ki-67在腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)非常低的表達(dá)，Ki-67

14、染色同樣證實(shí)為腫瘤細(xì)胞增殖率低，腸腺上皮中Ki-67高表達(dá)，可能是胃小凹腺體，與高細(xì)胞增殖率的腺上皮相比Ki-67在腫瘤細(xì)胞中缺少胞核表達(dá)。這些Ki-67標(biāo)記陰性的腫瘤細(xì)胞是低分級的神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞，第二節(jié)免疫組織化學(xué)染色前L的基本技術(shù)（）樣品的取材組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。細(xì)胞標(biāo)本后者包括組織印片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究.樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關(guān)系到實(shí)驗的結(jié)果。所以必須做好準(zhǔn)備工作?，F(xiàn)將組織取材的原則和具體要求分述如下:1刀男銳利

15、、潔凈。2快速、準(zhǔn)確、盡量保持生活狀態(tài),力爭1分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超過3分鐘。一刀切取，切取應(yīng)在蠟版或濾紙上進(jìn)行，讎覓拉畬、牽拉或擠壓無疝作。低溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以0C-4C的低溫條件下操作為佳。5、羊品大小適當(dāng)，光鏡樣品一般在仁Ocm以內(nèi),免疫組織化學(xué)樣品大約在：2cmX1.5cmX0.3cm厚度控制在0.3cmo電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-10cm共3小塊。對病理組織取材還應(yīng)做到以下幾點(diǎn):取材部位必須是主要病變區(qū)；必須取病灶與正常組織的交界區(qū)；必要時取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對照。細(xì)胞標(biāo)本的取材印片法:常用于活檢標(biāo)本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法=常用于淋巴結(jié)、軟

16、組織、腎、肝、肺等組織。注意事項:細(xì)胞經(jīng)離心后細(xì)胞粘附性較差，標(biāo)記過程中容易脫片，載玻片應(yīng)涂粘附劑細(xì)胞總數(shù)應(yīng)以105個為宜，并集中在直徑0.6-1.0cm的圓圈內(nèi)。富于粘液的標(biāo)本，未經(jīng)處理不宜作免疫組化標(biāo)記。1x目的:固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)、抗原完整性2、免疫組化標(biāo)本固定時，好的固定劑應(yīng)滿足哪些要求?能快速固定抗原；防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散；固定后的抗原能被抗體識別,不影響抗原抗體反應(yīng)。3、各種固定液:甲醛固定液：分類較多，最常用的4%多聚甲醛固定液，對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；主要特點(diǎn)：組織穿透性好，收縮性小但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液

17、，請于購置前注意說明書。BouinS固定液：飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長期保存。PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。（三）、組織脫水浸蠟及包埋脫水透明等過程需在4C或室溫下進(jìn)行，避免組織抗原的損失；為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚度以1.0-1.5mm為宜；浸蠟及包埋過程中，石蠟溫度應(yīng)保持在60C或60C以下，用熔點(diǎn)低的石蠟包埋；制備蠟塊在較低的溫度進(jìn)行，故試劑處理時應(yīng)適當(dāng)延長，否

18、則會給切片帶來困難I常用的包埋逆石蠟包埋冰凍干燥包埋塑料包埋（四）組織切片中載玻片的處理抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進(jìn)行，可選用PoIy-L-Lysine、ZLI-9001APESZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005等幾種試劑，對已常規(guī)清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下:PoIy-L-Lysine:將洗凈、干燥的載戒片放入以1：10比例去離子水襦釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60%烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。(五)抗原修復(fù)抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化

19、學(xué)(IHC)前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程。ijg切片為什么要做抗原修復(fù)？有那些方法?石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、竣甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽.所以要求在進(jìn)行IHC染色時,需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露,即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法,高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH60的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。1抗原修復(fù)方法T熱修復(fù)1v微波爐加熱法將玻片分別插入抗

20、原修復(fù)盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻在抗原修復(fù)盒中加入抗原修復(fù)液，蓋上帶有小孔的蓋子。將塑料盒置于微波爐中央，加熱2x5min。兩次加熱之間，加入50ml蒸憎水。加熱過程中，組織標(biāo)本不可干燥。第二次處理后，將微波爐中的修復(fù)盒移至室溫冷卻15-20分鐘。不要打開蓋子！蒸憾水沖洗。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶并置于蒸館水中。用TBS或PBS液沖洗。進(jìn)行免疫組化染色。2、壓力鍋法在壓力鍋中放入1500-3000mI抗原修復(fù)緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入切片架并放入沸騰的修復(fù)緩沖液中。后加閥，使之加壓2分鐘。后將壓力鍋置于流水槽或繼續(xù)冷卻20分鐘（減壓）。取出切片，蒸憎水沖洗，移至TBS或PBS液中，以

21、避免組織干燥。以下同微波爐修復(fù)法。二、酶消化方法抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FVIII等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）貝lj需要用酶消化法處理切片。匕胰蛋白酶處理:A滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。B室溫37C孵育20-40分鐘，孵育時間的長短依福爾馬林固定時間及所測抗原情況而定。C蒸館水沖洗，終止反應(yīng)。D阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。E免疫組化染色。A滴加胃蛋白酶工作液于組織上。B最佳消化時間取決于福爾馬林的固定時間，37C預(yù)熱。一般消化10分鐘,

22、長至30分鐘。C以下同胰蛋白酶處理方法3,4,5。翳鑑滬組織結(jié)構(gòu)的丟失微波爐加胰酶修復(fù)法：將組織切片畫于盛有50ml修復(fù)液的塑料盒中，封口膜封口后加熱5分鐘。冷卻后打開，將切片置于37C預(yù)熱的蒸館水中，胰蛋白酶消化。室溫胰蛋白酶處理30秒鐘。范福7k油殊阻斷內(nèi)源化物酶，置蒸憎水中。免疫組化染色。t巒乍中還應(yīng)注意如下問題:熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。2、熱處理時要防止切片干燥。3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。5、連意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變（一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會無明顯的破壞，而對細(xì)胞核的影響較大,會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象，而經(jīng)酶水解的切片，其細(xì)胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕）O6、如果在常用的緩沖液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù),或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或加一些螯合