基因工程基本原理及技術(shù)

1、基因工程基本原理及技術(shù)基因克隆(gene cloning )：是指目的基因與載體DNA連接構(gòu)成的DNA重組體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增（也包括目的基因的無細(xì)胞擴(kuò)增-PCR）的技術(shù)?；虮磉_(dá)(gene expression)：是基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯過程，也就是遺傳信息從核酸到蛋白質(zhì)的傳遞和實(shí)現(xiàn)?；蚬こ蹋╣ene engineering） 或稱重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technique）：是指將獲取的目的基因片段在體外與載體DNA通過人工剪切、編接構(gòu)成DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和 表達(dá)，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù),人為的改造基因,改變生物

2、的遺傳性狀的系列過程,總稱為基因工程.基因工程基本步驟目的DNA 制備；載體DNA選擇DNA體外重組技術(shù) （ DNA酶切實(shí)驗(yàn)、 連接實(shí)驗(yàn)）重組DNA的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）試驗(yàn) 重組克隆的篩選與鑒定（重組體的表型篩選，指紋圖譜法， PCR方法，探針雜交法 ） 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的篩選與鑒定（遺傳互補(bǔ)法，免疫化學(xué)法Western印雜交法，微細(xì)胞法(microcell method)圖l 基因工程操作流程一.基因克隆( 一) “工程原料”的獲取 -獲取目的基因 基因工程的原料就是目的基因。所謂目的基因，是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或DNA片段，能編碼某一產(chǎn)物或某一性狀。獲取目的基因 有三個途

3、徑：1.從生物基因組中分離純化（鳥槍法shotgun）：原核細(xì)胞DNA遺傳背景不清。組建基因文庫 檢測鑒定。 2.人工合成：依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，即可按密碼子推算出其基因的核苷酸序列，隨后應(yīng)用化學(xué)合成法，就可在短時間內(nèi)合成目的基因。 用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因3.酶促合成法-反向轉(zhuǎn)錄法：這種方法主要用于分子量較大而又不知其序列的基因. mRNA逆轉(zhuǎn)錄 cDNA做目的基因 ?？蒔CR法合成。Principle of PCRDNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dN

4、TP;Buffer;Mg2+,Primers)Chain reaction: Repeated cycles of reaction under the same condition.The PCR reactionAnneal Primers45-68CtemplatePrimers, dNTPs, Taq polymerase, Mg2+ExtendPrimers72CDenature95CWhat do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase?Round 1Anneal

5、 primersExtend primersThe exponential amplification of the gene in PCRThe first 4 cycles of a PCR reaction in detail. In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are c

6、opied.Optimum condition of PCRCorrect sources of template DNA Best temperature select in three steps Appropriate primers in both end Others: Mg2+; Inhibitoret al.Primer Design Is VitalPrimers should usually be 18-25 bases longNeed as much sequence information as possible outside target3 end of prime

7、r is most important: best to have G or C at endPrimers should have approximately equal melting temperaturesAvoid repetitive sequence( internal hairpin structures) Aim for 40-60% G+C content Avoid complementarities within or between primers Can modify 5 ends to add restriction sites etcTA Cloning Of

8、PCR Products Requires “A” sAAPCR productpGEM-TpCR 2.1-TOPOTaq- yesPfu- noTypical Reaction Mixture25 or 50l in a micro Eppendorf(0.5ml) tubeCOMPONENTVOLUMEFinal Concentration10PCR buffer5 l 110dNTPs(2mM)5 l 200 M Forward primer(10pmols/l )5 l1M (50pmols/50l)Reverse primer(10pmols/l )5 l1M (50pmols/50

9、l)Genomic DNA template2 l1 gThermostable polymerase (2U/ l )0.5 l1 unitH2O( to 50 l Final volume)27.5 lThe Perfect ResultReliable PCR form every Sample(二)、載體載體(Vector)是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。載體應(yīng)具備下列條件：(1) 有復(fù)制起點(diǎn)，能自我復(fù)制；(2)具有高效調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)；(3)對某一種限制酶只有一個切點(diǎn)；(4)必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記；(5)攜帶外源基因的幅度寬；(6)分子量

10、小，拷貝數(shù)多.載體的種類按來源分： 質(zhì)粒載體(plasmid vector)原核、噬菌體載體(phage vector)原核、柯氏質(zhì)粒載體(cosmid vector)真核、病毒載體(virus vector )真核.按作用分：克隆載體(cloning vector )、表達(dá)載體(expression vector)、穿梭載體(shuttle vector)1. 質(zhì)粒載體: (1)分子量較小,在細(xì)菌中有較多的拷貝數(shù)。 (2)松馳型:質(zhì)粒復(fù)制與染色體不同步和蛋白 質(zhì)合成功能無關(guān)。 (3)具有一個以上的標(biāo)志，便于篩選。 (4)具有數(shù)個或一個單一的酶切點(diǎn)。 天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件，所以實(shí)際應(yīng)

11、用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322 ，pUC19。AmprLacZorio p2. 噬菌體載體野生型噬菌體 (Wild type phage ，wt ) DNA長度約為48.5kb (分子量3.2107)，在病毒顆粒中為雙鏈線形分子，具有12bp的粘性末端(cohesive end)，進(jìn)入大腸桿菌之后立即互補(bǔ)成環(huán)。入噬菌體作為克隆載體有兩個優(yōu)點(diǎn)： 1) 轉(zhuǎn)染效率高 :可在體外包裝，產(chǎn)生有感染性的噬菌體顆粒，每個顆粒都可能感染一個大腸桿菌. 2)篩選程序簡便 :一定長度的噬菌體才能包裝. 現(xiàn)改建的載體類型有：插入型載體如gt11; 替換型載體EMBL3、EMBL4 。3. 柯氏質(zhì)

12、?；蚍Q粘尾質(zhì)粒(cosmid) 是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。由入DNA c o s區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成.在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。cosmid的構(gòu)造特點(diǎn): (1)含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位。 (2)一個或多個單一酶的限制位點(diǎn) (3)帶有入噬菌體粘性末端。 (4)分子小，約46kb，可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構(gòu)建真核細(xì)胞的基因文庫特。另外，由于非重組體cosmid很小，不能在體外包裝,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。如 cosmid pHC794病毒載體 常用的動物病毒表達(dá)載體可分為兩大類：整合型（integrat

13、ed）載體即外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。這類載體的代表是 SV40PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLPGHL、pMSV 等。游離型(transient)或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。5克隆載體(cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細(xì)菌質(zhì)粒或與其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建。常

14、用載體pUC18 pUC 19.6表達(dá)載體(expression vector) 使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體。可將重組體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。7穿梭載體(shuttle vector) 又稱雙功能載體(bifunctional vector)。能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體.其可同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識別的病毒復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)

15、胞中表達(dá)，并可提高外源基因的表達(dá)效 率。如pKSV一10、pJDB219載體等。oriP o LacZkmram2（三）.限制性核酸內(nèi)切酶限制酶是一種必不可少的工具酶，是進(jìn)行DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀”或“分子手術(shù)刀”之稱。 1、概念：限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease ) 是指能專一地識別DNA分子上特定的堿基序列并將DNA切斷的內(nèi)切酶。 2、識別序列的特點(diǎn)(1)專一；(2)常由46個堿基組成；(3)具有回文序列(palindromic sequence)切口類型：(1)形成粘末端(cohesive end)：DNA分子末端的單鏈片段能與其他

16、DNA單鏈片段互補(bǔ)配對形成雙鏈者，這兩個DNA分子末端單鏈片段即為粘末端：如BamH 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5 5-NNNNNN-G GATCC-NNN-3 3NNNNNN-CCTAG G-NNN-5（2）形成平末端；SmaCCCGGG GGGCCC4、酶切反應(yīng)條件：（1）需要合適的底物：底物（DNA）純度要高.不能含有RNA和蛋白質(zhì);也不能含有過高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有機(jī)試劑。DNA 的濃度不宜過高，高濃度的DNA 會使溶液的粘待度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底。常為50ul內(nèi)含1ug DNA）（2）合適的酶量：酶和底物比例21

17、0u/ug DNA,避免使用過高的酶濃度（3）合適的反應(yīng)介質(zhì)（緩沖體系）：反應(yīng)均以Tris-Hcl作緩沖液；PH值多在7.48.0之間；反應(yīng)需要Mg2+激活；多數(shù)酶反應(yīng)尚需要2巰基乙醇（BME）或二硫基蘇糖醇（DTT）的存在。此外，許多酶反應(yīng)還需要NaCl ，但不同的酶對NaCl的需要量各有差別。（4）溫度和作用時間等：大多數(shù)限制酶的反應(yīng)溫度為370C，個別酶則需要500C、600C或650C的高溫。一般在適宜的緩沖液和溫度條件下，每微克DNA用15單位的酶，保溫12小時。 (四) DNA重組(連接)和基因轉(zhuǎn)移1、DNA重組（DNA recombination） 不同的DNA片段之間的連接需要

18、另一種工具酶-連接酶的幫助. 目的DNA酶切片斷載體DNA酶切片斷 T4DNA ligase DNA重組體. T4DN 連接酶(T4DN ligase):是從感染T4噬菌體的Ecoli中分離得到的一種連接酶，其催化兩個DNA片段的3一0H與5一P末端形成磷酸二酯鍵。 （1）粘末端連接(cohesive end ligate)： （a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。 用堿性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基團(tuán)，使5端帶一OH)處理載體，可防止載體自身環(huán)化。 （b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。 (2)平末端連接(bl

19、unt end ligate)：目的基因和載體用同一種能產(chǎn)生平末端的酶切割后連接，重組后保留原來的酶切位點(diǎn)，如Smal CCCGGG 所用酶量要大. 連接反應(yīng)條件 連接酶的活性; DNA的純度, 載體與目的基因的比例; PH值7.2-7.8適宜; 鎂離子、DTT(二硫基蘇糖醇,有促進(jìn)連接作用);ATP；; 14(不高于16)過夜。2、基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）把重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增.根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細(xì)胞及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。(1)受體細(xì)胞：大腸桿菌E.coli （EK系統(tǒng)）；優(yōu)點(diǎn): 細(xì)菌細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是： 操作簡單、增代時間短、價格低廉。

20、某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平很高缺點(diǎn):表達(dá)多肽分子常不能適當(dāng)?shù)卣郫B, 蛋白質(zhì)常無生物活性。 異體蛋白質(zhì)，常對細(xì)菌有毒性作用. 缺乏真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，例如在蛋白質(zhì)上加上磷酸根(phosphate)和糖基.枯草桿菌；酵母菌細(xì)胞；哺乳動物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞。受體細(xì)胞應(yīng)具備的主要條件是R-M- (限制酶和修飾酶缺陷)。受體菌處于感受態(tài)(2)轉(zhuǎn)化(transformation)： 以質(zhì)粒DNA為載體構(gòu)成的DNA重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方式稱轉(zhuǎn)化。 制備感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）：取對數(shù)生長期菌細(xì)胞，用CaCl2(冰冷)處理，使其易于接受外源DNA。 感受態(tài)菌與重組DNA混合放冰浴40分鐘；42

21、熱休克2分鐘；(如用AP平板培養(yǎng)基篩選，需37培養(yǎng)1小時)；涂到含有抗生素的平校培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)過夜。(3)轉(zhuǎn)染(trasfection) 以噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的DNA重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方式稱轉(zhuǎn)染。 選用受體細(xì)胞不同，轉(zhuǎn)染方式不同。若以大腸桿菌為受體菌轉(zhuǎn)染重組噬菌體DNA時，需要用噬菌體的包裝蛋白進(jìn)行體外包裝，形成有感染性的噬菌體顆粒，才能感染大腸桿菌受體細(xì)胞。以哺乳動物細(xì)胞做受體細(xì)胞時用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)和電穿孔（electroportion）轉(zhuǎn)染技術(shù)直接轉(zhuǎn)染重組體DNA。（五）克隆株的篩選與鑒定1.根據(jù)重組體的表型篩選 抗性基因插入失活（負(fù)性選擇法）pBR322； 顯色平板篩選法：如pUC19做載體(-互補(bǔ)）.LacZ-受體菌編碼-半乳糖苷酶羧基端（C端）片斷pUC載體編碼-半乳糖苷酶氨基端（N端）的肽 轉(zhuǎn)化菌株 含APr, X-gal和IPTG培養(yǎng)基 菌落顏色pUC19 rDNA Z基因失活、不表達(dá)一半 無色(白顏色) 乳糖苷酶、Xgal不被分解pU