醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、 高等醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教材醫(yī)修微望勃鳥免複修供臨床醫(yī)學(xué)、影像、護(hù)理、中醫(yī)等專業(yè)使用三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室二00五年六月高等醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教材醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)主編韓莉副主編張昌菊宋利瓊編者（以姓氏筆畫為序）王磊朱平劉嘉劉英宋利瓊吳紅艷楊建林周永芹張穎張昌菊韓莉三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物病原部2005年6月29日前言本教材由醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)兩部分組成，通過實(shí)習(xí)課教學(xué)使學(xué)生了解和掌握醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技能操作和基本研究方法，同時(shí)也能獲取相應(yīng)的感性知識。為培養(yǎng)學(xué)生的思維能力和獨(dú)立操作能力，在進(jìn)行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課教學(xué)時(shí)，學(xué)生也能利用本實(shí)習(xí)指導(dǎo)作為工具，順利地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以

2、節(jié)省學(xué)生獲取知識的時(shí)間。為此冃的，對每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的目的及實(shí)際意義都有所交代，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察與分析，也予以必要的輔導(dǎo)。限于教學(xué)時(shí)數(shù)和條件，有些內(nèi)容將以示教、電視或電影教學(xué)方式教學(xué)，這部分尤其需要加強(qiáng)復(fù)習(xí)，以彌補(bǔ)未能親自操作之不足。有關(guān)實(shí)驗(yàn)課的改革設(shè)想，仍須不斷地接受實(shí)踐考驗(yàn)，發(fā)揚(yáng)成績克服缺點(diǎn)，以不斷地充實(shí)和提咼。為上好實(shí)驗(yàn)課，要求同學(xué)課前做好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)任務(wù)、目的、原理、方法及操作中的注意事項(xiàng)等，避免和減少發(fā)生錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)過程中必須持嚴(yán)肅認(rèn)真的態(tài)度，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須進(jìn)行仔細(xì)地觀察和認(rèn)真地記錄，然后進(jìn)行科學(xué)分析，得出恰當(dāng)結(jié)論，獨(dú)立認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告要字跡清楚，語言簡練，表格清晰，畫圖應(yīng)力求

3、反映實(shí)際標(biāo)本的原狀。編者2005年6月29日內(nèi)容簡介第一篇醫(yī)學(xué)微生物學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)課程的重要組成部分，我們將醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容分為六個(gè)單元，改變以往單一的實(shí)驗(yàn)方式，在綜合性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開設(shè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生能比較系統(tǒng)地了解常用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)及用途，可以幫助學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識，培養(yǎng)學(xué)生的操作技能以及觀察問題，分析、解決問題的能力、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，同時(shí)實(shí)驗(yàn)與病案討論結(jié)合，學(xué)生能將理論知識與臨床實(shí)踐有機(jī)聯(lián)系,為學(xué)習(xí)其它基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)及預(yù)防醫(yī)學(xué)奠定基礎(chǔ)，從而提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。第二篇醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)踐教學(xué)是課程建設(shè)的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)和提高學(xué)生的

4、綜合素質(zhì)與創(chuàng)新能力重要途徑。在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中我們大力改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)的形式和內(nèi)容，將免疫學(xué)的16學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為兩大部分，第一部分為綜合性實(shí)驗(yàn)，包括了解天然免疫的組成與生物學(xué)功能的檢測；常見體液免疫檢測指標(biāo)的設(shè)計(jì)，使學(xué)生能較熟練應(yīng)用基本的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，能針對不同的臨床病例開展相關(guān)免疫學(xué)項(xiàng)目的基本檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行合理的臨床解釋和分析。為了學(xué)生既能適應(yīng)一般臨床與科研工作，又具有一定的創(chuàng)新工作能力。第二部分我們開設(shè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)：市場有某一生物制劑有免疫增強(qiáng)作用，請?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案證實(shí)。在這部分內(nèi)容要求同學(xué)們初步掌握從不同角度證實(shí)某產(chǎn)品有免疫增強(qiáng)作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，掌握與了解常見細(xì)胞免疫的檢測技術(shù)和應(yīng)用（

5、ELISA檢測細(xì)胞因子）、免疫標(biāo)記技術(shù)的種類、原理、特點(diǎn)、應(yīng)用、淋巴細(xì)胞分離記數(shù)技術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)。第一篇醫(yī)學(xué)微生物學(xué)TOC o 1-5 h z實(shí)驗(yàn)室規(guī)則6 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 實(shí)驗(yàn)一常見細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法（綜合性實(shí)驗(yàn)）7實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的分離培養(yǎng)法與消毒滅菌（綜合性實(shí)驗(yàn)）15 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document 實(shí)驗(yàn)三化膿性球菌的分離鑒定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）30 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 實(shí)驗(yàn)四腸道桿菌的分離鑒定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）34

6、HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 實(shí)驗(yàn)五厭氧菌、分支桿菌的檢查法（綜合性實(shí)驗(yàn)）43 HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 實(shí)驗(yàn)六各種微生物形態(tài)、病毒學(xué)檢查法（綜合性實(shí)驗(yàn)）49 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 微生物學(xué)各論自學(xué)提綱59第二篇醫(yī)學(xué)免疫學(xué) HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 實(shí)驗(yàn)一天然免疫功能的檢測（綜合性實(shí)驗(yàn)）60 HYPERLINK l bookmark24 o Current Docu

7、ment 實(shí)驗(yàn)二常見抗原抗體反應(yīng)（綜合性實(shí)驗(yàn)）67實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞免疫檢測I：細(xì)胞因子的檢測（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）86實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞免疫檢測IL淋巴細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)及活性檢測（設(shè)計(jì)性驗(yàn)）96實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞免疫檢測III：淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）105綜合復(fù)習(xí)104附錄115實(shí)驗(yàn)室規(guī)則由于實(shí)驗(yàn)對象主要是病原微生物，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格遵守下列規(guī)則：一、必須穿工作服（白大褂）才能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，除必要的書籍、文具外,其它雜物不得帶入室內(nèi)，離室時(shí)脫下的白大褂折疊好。二、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吸煙、飲食，不準(zhǔn)口吸移液管或用嘴濕潤鉛筆、標(biāo)簽等。實(shí)驗(yàn)室要保持肅靜和秩序，不得高聲談笑和隨處走動(dòng)。三、實(shí)驗(yàn)室中若不慎發(fā)生病菌污染桌面、衣物、傷口

8、等意外，請報(bào)告指導(dǎo)教師進(jìn)行適當(dāng)處理，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理辦法：皮狀破損：先除去異物，用生理鹽水或蒸館水洗凈后，涂2%紅汞或2%碘酊。燒傷：局部涂凡士林、5%革柔酸或2%苦味酸?；瘜W(xué)藥品腐蝕傷：強(qiáng)酸先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和。強(qiáng)堿-先用大量清水沖洗，再用5%硼酸溶液洗滌中和。如受傷處為眼部，經(jīng)上述步驟處理后，用橄欖油或液體石蠟12滴滴眼。菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器內(nèi)，并用1：1000高鐳酸鉀液或3%雙氧水漱口；根據(jù)菌種不同，服用抗菌藥物預(yù)防感染。菌液污染桌面：將適量23%來蘇或0.1%新潔爾滅傾倒于污染處,浸泡30分鐘后抹去。如手上沾有活菌，亦應(yīng)浸泡于上述消毒液

9、3分鐘后，再用肥皂和清水洗凈。火警：如發(fā)生火警時(shí)須沉著、冷靜，切勿驚慌，應(yīng)立即關(guān)閉電閘和煤氣閥門。如為酒精、乙醯、汽油等有機(jī)溶液起火，切忌用水撲救，可用沙土等撲滅。四、請愛護(hù)、節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料，若有損壞應(yīng)報(bào)告教師，適當(dāng)賠償。五、沾染過傳染材料的吸管、滴管、玻片等不要亂放亂動(dòng)，須按規(guī)定處理，未經(jīng)許可室內(nèi)物品不得攜出室外。六、實(shí)驗(yàn)完畢，及時(shí)清理實(shí)驗(yàn)室，肥皂、清水洗手；值日生打掃室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好水電、煤氣、門窗、肥皂、清水洗手后離室。實(shí)驗(yàn)一、常見細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法（綜合性實(shí)驗(yàn)）【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌涂片制作及革蘭氏染色法。二、細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)觀察。三、細(xì)菌動(dòng)力的觀察（懸滴法）。四、顯微鏡油鏡的使用和

10、維護(hù)。五、電鏡觀察細(xì)菌的菌毛?！灸康囊蟆恳弧⒊醪秸莆占?xì)菌涂片制作過程及革蘭染色的操作技術(shù)。二、認(rèn)識細(xì)菌基本形態(tài)。三、了解細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)及其與醫(yī)學(xué)實(shí)踐關(guān)系。四、初步掌握油鏡的使用和維護(hù)。五、了解電鏡在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究中的應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)原理】一、革蘭染色法細(xì)菌染色法是細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查的一項(xiàng)基本技術(shù)。由于細(xì)菌個(gè)體微小，無色半透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易清晰觀察，一般需經(jīng)染色來增加反差，從而有利于對細(xì)菌標(biāo)本的觀察。染料有帶陰離子著色基團(tuán)的酸性染料和帶陽離子著色基團(tuán)的堿性染料。在一般生理?xiàng)l件下（PH7.4左右），細(xì)菌菌體都帶負(fù)電荷，故用于細(xì)菌染色的染料多為帶陽離子著色基團(tuán)的苯胺染料，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅

11、等，它們較易與細(xì)菌菌體結(jié)合。染色方法可分單染色法和復(fù)染色法兩大類。前者只用一種染料染色，只能觀察細(xì)菌的形態(tài)和排列，不能顯示細(xì)菌結(jié)構(gòu)及染色反應(yīng)性；后者是以兩種以上的染料染色，可顯示出細(xì)菌的待殊結(jié)構(gòu)或染色反應(yīng)性能，在細(xì)菌的鑒別上有一定意義，其中最常用的為革蘭染色法。細(xì)菌革蘭（Gram）染色是最常用的細(xì)菌鑒別染色法，首先由Gram創(chuàng)用而得名。細(xì)菌染色后不僅可區(qū)別其形態(tài)和排列方式，還可根據(jù)染色結(jié)果將所有細(xì)菌分成革蘭陽性菌與革蘭陰性菌兩大類；不被酒精脫色仍保留紫色者為革蘭陽性菌（L菌），被酒精脫色后復(fù)染成紅色者為革蘭陰性菌（&菌）。革蘭染色法不僅有助于細(xì)菌的鑒別，同時(shí)還為分析細(xì)菌的致病性和選用抗菌藥物提

12、供了依據(jù)。革蘭染色的原理目前存在三種假說：通透性學(xué)說革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入。等電點(diǎn)學(xué)說革蘭陽性菌等電點(diǎn)（pl2、3）比革蘭陰性菌（pl45）低，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色。化學(xué)學(xué)說革蘭陽性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使己著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。在細(xì)菌標(biāo)本染色前，必須將細(xì)菌固定在載玻片上，常用的固定方法為加熱法，其目的是殺死細(xì)菌，且保持原有形態(tài)，并使細(xì)菌粘附

13、在載玻片上，不致染色時(shí)脫落。二、細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察細(xì)菌形體微小，且為無色半透明，必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜旧?，?jīng)顯微鏡（如圖1）放大1000倍才能觀察清楚，故須用油鏡觀察。使用油鏡時(shí)，要在標(biāo)本上滴加香柏油，其目的是增加進(jìn)入透鏡的光線，使視野明亮度加強(qiáng)，物象才看的清楚。原理為：透鏡的孔徑小，進(jìn)入的光線先通過標(biāo)本玻片，再通過透鏡與油鏡頭之間的空氣，然后進(jìn)入油鏡頭。由于玻片與空氣折射率不同，光線通過兩種折射率不同的介質(zhì)，就會發(fā)生折射（如圖2）,以至進(jìn)入油鏡頭的光線不夠強(qiáng)，致使物象不清晰。當(dāng)油鏡頭與玻片之間加香柏油后，由于香柏油的折射率（1.515）和玻璃的折射率（1.52）相仿，因此，進(jìn)入透鏡的光線

14、增加了（如圖2）。視野明亮度加強(qiáng)，物象也就看得清楚了。圖-2油鏡的原理細(xì)菌的基本形態(tài)可分為球菌、桿菌和螺形菌三類。球菌按其分裂繁殖方向與分裂后排列情況乂分為雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等；桿菌也有球桿菌、鏈桿菌、分枝桿菌、棒狀桿菌等之分；螺形菌中菌體僅有一個(gè)彎曲，呈逗點(diǎn)狀者叫弧菌,菌體有23個(gè)彎曲，且較僵硬者為螺菌。某些細(xì)菌除了有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和核質(zhì)這些基本結(jié)構(gòu)外，還具有其他特殊結(jié)構(gòu)，包括莢膜、鞭毛、菌毛和芽抱。這些特殊結(jié)構(gòu)有著各自的不同意義。三、細(xì)菌動(dòng)力的觀察（懸滴法）許多桿菌、弧菌具有鞭毛，有動(dòng)力，在液體中能從一個(gè)地方較快速地移動(dòng)到另一個(gè)地方。一般球菌無鞭毛，沒有動(dòng)

15、力，但受到所處環(huán)境中液體分子的沖擊而僅呈位置變更不大的顫動(dòng)。四、電鏡觀察細(xì)菌的菌毛電子顯微鏡是根據(jù)電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，使物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器。電子顯微鏡的分辨能力以它所能分辨的相鄰兩點(diǎn)的最小間距來表示。20世紀(jì)70年代，透射式電子顯微鏡的分辨率約為0.3納米（人眼的分辨本領(lǐng)約為0.1毫米）。現(xiàn)在電子顯微鏡最大放大倍率超過300萬倍，而光學(xué)顯微鏡的最大放大倍率約為2000倍，所以通過電子顯微鏡就能直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子。【實(shí)驗(yàn)材料與儀器】一、無菌牙簽、革蘭染色液（結(jié)晶紫染液、碘液、95%酒精、復(fù)紅染液）、生理鹽水、

16、載玻片、沖洗用具等二、普通光學(xué)顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙三、球菌、桿菌、螺形菌及特殊結(jié)構(gòu)示教片四、葡萄球菌、變形桿菌幼齡（812小時(shí)）肉湯培養(yǎng)物、凹玻片、蓋玻片、凡士林等五、電鏡H-7500,放大倍數(shù)2060萬倍，最大分辨能力0.204nm【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】一、細(xì)菌涂片制作及革蘭氏染色法制片：（1）涂片：取清潔玻片一張，在玻片的中央滴一小滴生理鹽水（滴加生理鹽水不宜過多）。用無菌牙簽挑取牙垢少許，與玻片上的水滴混勻，涂布成一厘米大小的均勻薄膜。（2）干燥：將涂片放室溫中自然干燥，切勿緊靠火焰烘烤，以免標(biāo)本烤焦，損害菌體結(jié)構(gòu)。（3）固定：持玻片一端，標(biāo)本面向上，迅速通過火焰三次（約23秒），

17、以玻片溫度達(dá)到皮膚能耐受的溫度為宜。固定的目的是殺死細(xì)菌，使其固定于玻片上，并能增強(qiáng)細(xì)菌對染料的通透性。革蘭染色：（1）初染：將已固定的涂片標(biāo)本，加結(jié)晶紫染液于涂面上染色1min,然后水洗。（2）媒染：加革蘭氏碘液媒染1min,水洗。（3）脫色：滴加95%酒精，頻頻搖動(dòng)載玻片，斜持載玻片，使脫下的染液流下，再次滴加酒精脫色，直至流下酒精無色或稍呈淡紫色為止，水洗。（4）復(fù)染：用稀釋復(fù)紅或沙黃染液復(fù)染30s至lmin,水洗，自然干燥或吸水紙印干。觀察結(jié)果：用油鏡觀察染好后的標(biāo)本片，記錄所見結(jié)果，染成紫蘭色者為革蘭氏陽性菌，染成紅色者為革蘭氏陰性菌。注意事項(xiàng)玻片一定要清潔無油。加生理鹽水切莫貪多以

18、免難于干燥，涂片要均勻且薄。固定標(biāo)本時(shí)切勿過熱，以免菌體變形。要掌握好染色時(shí)間，尤其是酒精脫色的時(shí)間，不宜過長或過短，以脫色至涂片為灰色為宜。水洗時(shí)要以細(xì)流水徐緩沖洗，否則會將玻片上的標(biāo)本沖掉。二、細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)觀察方法（1）使用顯微鏡油鏡、觀察各種球菌、桿菌和螺形菌以及細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的示教片，比較各菌的形態(tài)、大小、排列和特殊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。（2）繪圖：將觀察到的結(jié)果畫在報(bào)告紙上并加以適當(dāng)?shù)拿枋?。結(jié)果（1）細(xì)菌基本形態(tài)的觀察球菌：見排列方式不同的各種球菌，而且革蘭染色性亦不同。桿菌：大腸桿菌為革蘭陰性的短桿菌；炭疽桿菌為革蘭陽性桿菌，可見菌體粗大，兩端平齊，酷似竹節(jié)狀?；【夯【鸀楦锾m陰性菌

19、，菌體略帶彎曲，呈逗點(diǎn)狀或括弧形，霍亂弧菌涂片染色可出現(xiàn)“魚群狀”的排列特點(diǎn)。（2）細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)觀察：肺炎鏈球菌（莢膜）：肺炎鏈球菌為革蘭陽性菌，成雙排列。在雙球菌體外圍有一層較厚的透明區(qū)域，即為莢膜。變形桿菌（鞭毛）：變形桿菌為革蘭陰性菌，通過鞭毛染色，可見菌體周圍有細(xì)長彎曲的數(shù)根絲狀物，即為鞭毛。破傷風(fēng)梭菌（芽他）：破傷風(fēng)梭菌為革蘭陽性菌。經(jīng)芽胞染色后，可見菌體頂端有一圓形，比菌體寬的結(jié)構(gòu)，即為芽胞。芽胞與菌體相連形似鼓槌狀，在細(xì)菌中為獨(dú)有的形態(tài)。肉毒梭菌菌體次極端有一橢圓形、比菌體寬的芽胞，與菌體相連,形似網(wǎng)球拍狀。三、細(xì)菌的動(dòng)力觀察（懸滴法）圖3細(xì)菌的動(dòng)力觀察（懸滴法）制片方法取凹玻片

20、兩張、在凹窩周圍涂抹少許凡士林。各取一接種環(huán)的變形桿菌、葡萄球菌幼齡培養(yǎng)物，分別放于兩塊蓋玻片中央。將凹玻片反轉(zhuǎn)。使凹窩對準(zhǔn)蓋玻片中心，覆于其上，粘住蓋玻片后再反轉(zhuǎn)。以接種環(huán)柄輕壓蓋玻片，使與凹窩邊緣粘緊。先以低借鏡找至懸滴的邊緣后，再換用高倍鏡觀察（因凹玻片較厚，油鏡焦距很短，故一般不能用油鏡來檢查）。觀察時(shí)，注意比較變形桿菌和葡萄球菌的運(yùn)動(dòng)情況有何不同。注意事項(xiàng)觀察懸滴標(biāo)本時(shí)，先用低倍鏡找到懸滴的邊緣，然后將視野移至懸滴中央，將集光器下降，縮小光圈，使亮度減弱，再用高倍鏡觀察，否則亮度太強(qiáng)，不好觀察。調(diào)節(jié)螺旋時(shí)，切忌過度下旋，以免壓碎蓋玻片。用接種環(huán)在試管中取材的方法（如圖4）：左手拇指、

21、食、中三指持試管底，右手拇、食、中三指握筆式持接種環(huán)，并垂直于火焰上燒灼至發(fā)紅為止。移至火焰旁待冷。在火焰附近用右小指夾取試管上的棉塞，移動(dòng)后輕輕拔出，并持于小指與小魚際之間，不得將棉塞放置桌上或觸及任何物品。將試管口移至火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，滅菌后移至火焰附近，用冷卻后的接種環(huán)插入試管內(nèi)取少許生理鹽水(若為液體則沾取一環(huán)菌液后退出)，接種環(huán)不可與試管壁接觸,以免環(huán)上生理鹽水碰落。取出后立即將管口在火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)滅菌后塞上棉塞。接種環(huán)使用后經(jīng)燒灼滅菌插入試管架上。接種環(huán)滅國注細(xì)菌培養(yǎng)物的取材圖4接種環(huán)在試管中取材的方法四、油鏡的使用和保護(hù)光源的釆用實(shí)驗(yàn)室里通常采用間接陽光，日光燈，或顯微鏡照燈。使用顯微

22、鏡照燈時(shí)，通常要加一蘭色濾光片，以濾過黃色光線。觀察染色標(biāo)本時(shí)，要求有較強(qiáng)的光線，故應(yīng)把光圈開足，把集光器上升至與載物臺相平。鏡檢要領(lǐng)把載玻片固定于載物臺上，利用低倍鏡來對準(zhǔn)光，并尋找標(biāo)本范圍，旋轉(zhuǎn)回轉(zhuǎn)板，使油鏡頭對準(zhǔn)鏡筒。于載玻片上滴一小滴香柏油，眼睛從鏡筒側(cè)面看，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器，使鏡筒下降浸入鏡油并貼近標(biāo)本，但勿觸及玻片。然后將眼睛移至目鏡，一面觀察，一面把粗調(diào)節(jié)器作些微轉(zhuǎn)動(dòng)，待看到模糊物象時(shí)，再旋轉(zhuǎn)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。保護(hù)方法鏡檢完畢后，把鏡筒升高，用擦鏡紙把油鏡頭上的鏡油擦凈，如油已干，或透鏡模糊不清，可以用擦鏡紙沾少量二甲苯擦凈，然后再用干的擦鏡紙把二甲苯擦去。旋轉(zhuǎn)回轉(zhuǎn)板，使物鏡頭

23、呈八字形，降低鏡筒，把集光器稍微下降，然后把顯微鏡裝入鏡箱，鎖緊箱門，以防跌出及塵埃侵入。顯微鏡應(yīng)放置于干燥的地方，以防止鏡頭發(fā)霉，但也要避免陽光曝曬。（4）酸、堿、酒精、乙醯等物對鏡頭均有損壞作用，禁用于擦拭鏡頭。注意事項(xiàng)顯微鏡使用時(shí)應(yīng)小心愛護(hù)，不得隨意拆卸。搬動(dòng)顯微鏡時(shí)，用一手持鏡臂，一手托鏡座平端。載物臺要放平，以防滴加的香柏油流出玻片。玻片干后才能加香柏油，滴時(shí)要避免氣泡形成，香柏油要適量，不宜過多或過少。調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器時(shí)，動(dòng)作要輕，側(cè)面觀察鏡頭和玻片的距離，注意使鏡頭與玻片不相碰。用擦鏡紙擦拭油鏡頭時(shí)，注意手法輕柔，并按同一方向拖拭，防止旋轉(zhuǎn)擦拭，以免損傷貴重的油鏡光學(xué)系統(tǒng)五、電鏡觀察

24、細(xì)菌的菌毛將變形桿菌幼齡肉湯培養(yǎng)物制備成一定濃度的懸浮液。滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上，數(shù)分鐘后吸去多余液體。滴上染液，負(fù)染色12分鐘。吸去多余染液，干燥后即可電鏡觀察?！舅伎碱}】一、據(jù)實(shí)驗(yàn)體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？為什么制片要完全干燥后，才能用油鏡觀察？油鏡的使用和保護(hù)方法注意那些事項(xiàng)？二、細(xì)菌的形態(tài)檢查法的基本程序是什么？細(xì)菌經(jīng)革蘭染色后，為什么有的呈紫色，有的呈紅色？能否根據(jù)細(xì)菌在顯微鏡下的形態(tài)來鑒別細(xì)菌。三、書寫牙垢涂片革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)報(bào)告并記錄細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)。【附】一、革蘭氏染色法各種染液的配制結(jié)晶紫染液用天秤量取結(jié)晶紫5g放乳缽內(nèi)研碎，一面研磨一面徐徐加入95%

25、酒精使之溶解。加入酒精全量為100ml,制成酒精飽和液（原液）。取原液20ml,與1%草酸鍍水溶液80ml混合，用濾紙過濾。供革蘭氏染色初染用。碘液碘1g碘化鉀2g蒸餡水300ml配法是先用數(shù)毫升蒸飾水溶解碘化鉀，然后加碘使其全溶解，最后加蒸館水至300mlo供革蘭氏染色媒染用。稀釋石碳酸復(fù)紅染液首先，取堿性復(fù)紅10g和95%酒精100ml,制成復(fù)紅酒精飽合液。取復(fù)紅飽和液10ml,與5%石碳酸水溶液90ml混合，用濾紙過濾，再用蒸飾水稀釋10倍。供革蘭氏染色復(fù)染用。二、鞭毛染色法(魏曦染色)染液配制:2ml飽和鉀明磯液,5ml50g/L石炭酸液和2ml200g/L蹂酸液混合。臨用時(shí)加1ml堿

26、性復(fù)紅乙醇飽和液混合后過夜，次日過濾后使用，3d內(nèi)使用效果最好。染色方法：先將鞭毛菌在肉湯培養(yǎng)基中傳代67次。取瓊脂斜面培養(yǎng)基吸出凝滲水，加入2ml無菌蒸鎘水，然后將肉湯中傳代的細(xì)菌接種于斜面瓊脂與液體交界處,再從該交界處向上劃一直線，放入溫箱中培養(yǎng)16h。用接種環(huán)從交界處取一環(huán)菌液，輕輕放入盛有34ml蒸懈水的小碟液體表面，使細(xì)菌自由彌散，浮在液體表面，靜置于孵箱內(nèi)45min后，用接種環(huán)取一環(huán)液面混合液放于高度潔凈的載玻片上，切勿研磨和搖動(dòng)。置35C或室溫下讓其自然干燥，切勿火焰固定，加數(shù)滴染液染色0.51min,水洗，干后鏡檢，可見菌體和鞭毛均呈紅色。三、莢膜染色法染液：結(jié)晶紫乙醇飽和液5

27、ml加蒸飾水95ml,混勻；20%(200g/L)硫酸銅水溶液。染色方法：將經(jīng)小白鼠傳代培養(yǎng)的肺炎鏈球菌進(jìn)行涂片，在空氣中自然干燥，無需加熱固定，先滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱，使玻片上染液冒蒸汽為止。不要水洗，用硫酸銅水溶液沖洗，用吸水紙吸干后油鏡觀察，結(jié)果菌體及背景呈紫色，菌體周圍有一圈淡紫色或無色的莢膜。四、芽胞染色法染液：石炭酸復(fù)紅染液、95%乙醇、堿性美藍(lán)染液。方法：用芽胞菌制成涂片，干燥后加熱固定，加數(shù)滴石炭酸復(fù)紅液，微加熱染色5min,冷卻后用流水沖洗，用95%乙醇脫色2min,水洗，再加數(shù)滴堿性美藍(lán)30sec,水洗，吸水紙吸干后鏡檢。其結(jié)果為菌體呈藍(lán)色，芽胞呈紅色。實(shí)驗(yàn)二細(xì)

28、菌的生長繁殖與消毒滅菌(綜合性實(shí)驗(yàn))CV1【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、培養(yǎng)基制備、種類、用途。二、細(xì)菌的分離接種技術(shù)及生長情況的觀察。三、消毒滅菌的方法?！灸康囊蟆恳?、了解培養(yǎng)基的制備過程及常用培養(yǎng)基的種類，初步學(xué)會細(xì)菌的接種方法及無菌操作法。二、觀察細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象。三、認(rèn)識常用的物理和化學(xué)消毒滅菌法。四、觀察藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果并了解其臨床意義。【實(shí)驗(yàn)原理】一、培養(yǎng)基是指在人工培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，提供給細(xì)菌生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)的制品。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中所含的營養(yǎng)物質(zhì)能滿足一般病原菌生長繁殖所需的氮源、碳源和無機(jī)鹽等。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加一些特殊成分(如糖類、血液、抑制劑等)則可制成營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別

29、培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。此外，還需具備一定的酸堿度(pH)、溫度、滲透壓、必要的氣體、無菌等要求，用于人工培養(yǎng)各類細(xì)菌。二、固體培養(yǎng)基的平板是從混雜的材料中分離出所需的細(xì)菌，以獲得純種；瓊脂斜面培養(yǎng)基一般供細(xì)菌繁殖，用作純培養(yǎng)；某些特殊斜面培養(yǎng)基可作觀察生化反應(yīng)等特殊用途;普通液體培養(yǎng)基一般作增菌用；半固體培養(yǎng)基可用來檢測細(xì)菌是否具有動(dòng)力。三、不同細(xì)菌的新陳代謝特點(diǎn)不同，在各種培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象不同，有利于鑒別與利用細(xì)菌；不同細(xì)菌對不同抗生素的敏感性不同，藥物敏感試驗(yàn)幫助我們了解細(xì)菌對抗生素的敏感性，指導(dǎo)臨床用藥。四、消毒(Disinfection)：殺滅病原微生物的方法。用以消毒的藥物稱為消毒

30、劑(Disinfectants)-般消毒劑在常用濃度下，只對細(xì)菌繁殖體有效。對于芽胞則需要提高消毒劑的濃度和延長作用的時(shí)間；滅菌(Sterilization)：殺滅物體上所有的微生物(包括病原體和非病原體的繁殖體和芽胞)的方法。無菌(Asepsis)指物體上或容器內(nèi)無活菌存在的意思。無菌操作是防止微生物進(jìn)入機(jī)體或其他物品的操作技術(shù)。例如，進(jìn)行外科手術(shù)或微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，須注意無菌操作；防腐(Antisepsis)指防止或抑制微生物生長繁殖的方法。用于防腐的化學(xué)藥物稱為防腐劑，許多藥物在低濃度時(shí)只有抑菌作用,濃度增高或延長作用時(shí)間，則有殺菌作用。物理消毒滅菌法即利用溫度、輻射、超聲波等物理?xiàng)l件的改

31、變，使得蛋白質(zhì)變性；核酸斷裂或變構(gòu),從而抑制細(xì)菌代謝和生長或損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，破壞其生理功能等，從而起到消毒滅菌作用的方法?；瘜W(xué)消毒滅菌法：利用化學(xué)藥物滲透細(xì)菌的體內(nèi)，使菌體蛋白凝固變性，干擾細(xì)菌酶的活性，抑制細(xì)菌代謝和生長或破壞細(xì)胞壁、損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變其滲透性，破壞其生理功能等，從而起到消毒滅菌作用。所用的藥物稱化學(xué)消毒劑。有的藥物殺滅微生物的能力較強(qiáng)，可以達(dá)到滅菌，乂稱為滅菌劑。凡不適于物理消毒滅菌而耐潮濕的物品，如銳利的金屬、刀、剪、縫針和光學(xué)儀器（胃鏡、膀胱鏡等）及皮膚、粘膜，病人的分泌物、排泄物、病室空氣等均可釆用此法?！緦?shí)驗(yàn)材料與儀器】一、各種培養(yǎng)基成品、血液（脫纖維羊血或兔

32、血）約1020mlo二、枯草桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌等菌種。三、接種環(huán)（針）、培養(yǎng)皿、試管等。四、藥物紙片、酒精、銀子?！緦?shí)驗(yàn)方法與步驟】一、培養(yǎng)基制備一般培養(yǎng)基的制備過程準(zhǔn)確稱量培養(yǎng)基各成分、混合溶解、測定及矯正pH-分裝、包裝一滅菌一檢定一保存。常用培養(yǎng)基的種類根據(jù)不同細(xì)菌的營養(yǎng)要求及實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹瞥傻呐囵B(yǎng)基種類很多,按培養(yǎng)基的作用可分為：（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有細(xì)菌需要的最基本營養(yǎng)成分，按物理性狀可分為液體（普通肉湯）培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。具體過程：按一定稀釋度加熱熔化牛肉膏或溶成普通瓊脂培養(yǎng)基。15磅高壓蒸氣滅菌2030min。趁熱將熔化的培養(yǎng)基倒入滅菌試管或滅

33、菌平皿內(nèi)，每個(gè)試管按不同實(shí)驗(yàn)要求倒入一定數(shù)量，每個(gè)平皿約15ml,凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基：供培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌用，如血瓊脂培養(yǎng)基（加熱熔化普通瓊脂培養(yǎng)基待冷至50C左右時(shí)，加入無菌的脫纖維血液，混勻（注意勿產(chǎn)生泡沫）分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培養(yǎng)基），血清肉湯培養(yǎng)基（在普通肉湯培養(yǎng)基中加入血清）。另外還有選擇培養(yǎng)基，可選擇性抑制非病原菌的生長，有利于分離病原菌，如中國藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基。鑒別培養(yǎng)基是供細(xì)菌生化反應(yīng)試驗(yàn)用的，以鑒定細(xì)菌，如糖發(fā)酵管、含鐵雙糖培養(yǎng)基。

34、厭氧培養(yǎng)基用以培養(yǎng)厭氧菌，如皰肉培養(yǎng)基。二、細(xì)菌的分離接種技術(shù)及生長情況的觀察（一）細(xì)菌的分離接種法：平板劃線分離培養(yǎng)法細(xì)菌在自然界中分布廣、種類多，而被檢材料乂常含有一種以上的細(xì)菌，為了對特定細(xì)菌進(jìn)行研究或鑒定，必須從混雜的材料中分離出所需的細(xì)菌，以獲得純種。分離的方法有多種。常用平板分區(qū)劃線法。燒灼滅菌接種環(huán)，以接種環(huán)取一環(huán)混合菌液。左手立即持起平板，五指固定平皿蓋邊緣，向外反轉(zhuǎn)手掌使平皿蓋向上，則平板落于手掌內(nèi)，用拇指和中指固定平皿邊緣，再向內(nèi)反轉(zhuǎn)手掌，使平皿蓋向下放于桌面上，但此時(shí)手指仍持住平皿邊緣，并稍微提起，作好備用狀態(tài)（如圖1）。左手斜持（45角）平板，右手持已取材的接晶打兩矗固

35、ItWS邊緣使雙手等高，平板在煤氣燈或酒精燈火焰前上方56cm距離，以右手持接種環(huán)在平板上側(cè)的原始部位30。40角度反復(fù)涂45次，然后燒灼接種環(huán)，待冷后，稍微通過原始部位向圖示“1”區(qū)引出直線，如圖示“1”區(qū)往返劃線；旋轉(zhuǎn)平板，重新燒灼接種環(huán),待冷后，通過“1”區(qū)向“2”區(qū)引出一直線往返劃線，如此重復(fù)4次。要求：劃線每區(qū)之間只有一條線連接；劃線既密乂不重疊；四個(gè)區(qū)占據(jù)整個(gè)平板為宜（見圖2）。圖67劃線分離的方法左：分區(qū)右：培養(yǎng)后的結(jié)果圖2四區(qū)平板劃線法劃線完畢，將平板放進(jìn)平板蓋內(nèi)，并在平板底玻璃上用蠟筆標(biāo)明標(biāo)本（菌種）名稱，班室座號、日期，將平板倒置（底在上）放于37C孵育箱培養(yǎng)。經(jīng)1824h

36、后取出，觀察平板表面生長的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、透明度、顏色等特征。斜面培養(yǎng)基接種法取一菌種管與培養(yǎng)管置于左手食指、中指、無名指之間，拇指壓住試管底部上方,使菌種管靠近火焰一側(cè)，接種管位于外側(cè)，斜面均向上。右手拇指和食指分別松動(dòng)兩管棉塞，火焰滅菌接種環(huán)。以右手小指與手掌，小指與無名指分別拔取兩管棉塞（先外后內(nèi)），將兩管口迅速通過火焰滅菌。將滅菌的接種環(huán)插入菌種管，從斜面上取菌苔少許。退出菌種管，迅速伸入待接種的培養(yǎng)管，在斜面上先由底部向上拉一條線，再從斜面底部向上輕輕曲折連續(xù)劃線（見圖3）o取出接種環(huán)，在火焰上滅菌管口，順序塞上棉塞（先塞菌種管，后塞接種管），然后滅菌接種環(huán)；做好標(biāo)

37、記。37C孵育1824h后觀察結(jié)果。細(xì)菌在培養(yǎng)管中的接種線上,生長出許多菌落連成一片，形成了菌苔。不同種的細(xì)菌菌苔，其透明度、顏色等特征不同。圖6-5A止確圖3斜面接種扌6切不正確液體培養(yǎng)基礎(chǔ)接種法肉湯、蛋白月東水、各種單糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基都用本法接種細(xì)菌。接種肉湯經(jīng)孵育后，可觀察細(xì)菌不同生長情況。有的均勻混濁，有的沉淀生長，亦有表面形成菌膜。其他的液體培養(yǎng)基接種后，大多供作測定生化特性使用。如斜面培養(yǎng)基接種法握持菌種管，挑取少量菌苔，伸入待接種的培養(yǎng)基管內(nèi)，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)液調(diào)和，使菌混合于其中（見圖4）。穿刺接種法凡培養(yǎng)基制好后，其外形呈一圓柱直立于試管內(nèi)者，均

38、用穿刺法接種之。屬于此類接種法的有半固體瓊脂培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基等。（1）如斜面培養(yǎng)基接種法握持菌種管及待接種管培養(yǎng)基。（2）右手持接種針，滅菌冷卻后，以針挑取菌苔接種半固體培養(yǎng)基時(shí)，垂直刺入培養(yǎng)基的中心。接種醋酸鉛培養(yǎng)基時(shí)，則沿管壁的一側(cè)穿刺于近底部0.5cm處，然后循原路退出。半固體瓊脂培養(yǎng)基穿刺接種，主要是觀察細(xì)菌有無動(dòng)力。接種后經(jīng)孵育，有動(dòng)力的細(xì)菌，該細(xì)菌沿著接種向外擴(kuò)散，呈毛刷狀生長；無動(dòng)力的細(xì)菌，該力沿接種線生細(xì)菌生長的環(huán)境條件欲使細(xì)菌生長繁殖，除了合適的培養(yǎng)基（營養(yǎng)料）夕卜，尚需適宜的溫度（一般致病菌所需的溫度為37C）及一定的環(huán)境條件，例如有的細(xì)菌初次分離時(shí)，需在含

39、有510%C02的環(huán)境中，因此培養(yǎng)細(xì)菌的方法，通常有以下三種。（1）需氧培養(yǎng)法將己接種的試管或平皿培養(yǎng)基放置37C溫箱中培養(yǎng)1824小時(shí)。（2）厭氧培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)的裝置和儀器目前常用的有厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋、旋轉(zhuǎn)管和手套箱等，具體內(nèi)容見實(shí)驗(yàn)五。（3）二氧化碳（CO：）培養(yǎng)法某些細(xì)菌如腦膜炎球菌、布魯氏桿菌等，初次分離培養(yǎng)在含510%C0：的環(huán)境中生長較好。一般最簡單的二氧化碳培養(yǎng)法是將接種好的培養(yǎng)基放在玻璃缸中，在缸內(nèi)燃點(diǎn)一支蠟燭，將玻璃缸用蓋密封，當(dāng)燭火熄滅時(shí)，缸內(nèi)即己含一定量的二氧化碳。細(xì)菌的生長現(xiàn)象的觀察（1）液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象均勻混濁狀態(tài)：大多數(shù)細(xì)菌屬此類。沉淀生長：主要是呈

40、鏈狀的細(xì)菌。表面菌膜：多是專性需氧菌。（2）固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：菌落與菌苔。菌落是細(xì)菌劃線接種于固體培養(yǎng)基表面，由于劃線的分散作用，使許多混雜的細(xì)菌在培養(yǎng)基表面上散開，經(jīng)過一定時(shí)間的培育后繁殖成為一堆堆的細(xì)菌集團(tuán)，肉眼可見。在一般情況下，一個(gè)菌落是由單獨(dú)一個(gè)細(xì)菌不斷分裂反之堆積而成，屬于同一種細(xì)菌，挑出一個(gè)菌落，移種到另一個(gè)培養(yǎng)基中，則所生長出來的細(xì)菌均為純種，即純培養(yǎng)。觀察細(xì)菌菌落大小、顏色、表面光滑或粗糙、濕潤或干燥、邊緣是否整齊以及透明度等方面，有助于識別和鑒定細(xì)菌，并根據(jù)固體培養(yǎng)基上菌落的數(shù)目，計(jì)算標(biāo)本中的活菌數(shù)。瓊脂斜面培養(yǎng)基上許多菌落融合在一起，形成菌苔。（3）半固體培養(yǎng)基上的

41、生長現(xiàn)象如菌有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，則細(xì)菌從穿刺線向四周半固體培養(yǎng)基中運(yùn)動(dòng)彌散，培養(yǎng)后沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀生長，穿刺線模糊不清。如菌無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。則細(xì)菌僅沿穿刺線成明顯的線形生長，周圍培養(yǎng)基仍然透明澄清。三、消毒滅菌:高壓蒸氣滅菌器（圖5）,煮沸消毒器（圖6）,（一）常用消毒滅菌器及濾菌器介紹電熱烤箱，細(xì)菌過濾器、超聲洗滌機(jī)等1.高壓蒸氣滅菌器：圖3-1手性式高壓姦汽滅菌器示意圖（1）構(gòu)造：高壓蒸汽滅菌器是一個(gè)雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅(jiān)固厚實(shí)，其上方有金屬厚蓋，蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸汽不能外溢，因而蒸汽壓力升高，隨著其溫度亦相應(yīng)地增高。高壓蒸汽滅菌器上裝有排氣閥門、安全活塞

42、，以調(diào)節(jié)蒸汽壓力。有溫度計(jì)及壓力表，以表示內(nèi)部的溫度和壓力。滅菌器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置要滅菌的物體（如圖）（2）用法：加水至外筒內(nèi)，被滅菌物品放入內(nèi)筒。蓋上滅菌器蓋，擰緊螺旋使之密閉。滅菌器下用煤氣或電爐等加熱，同時(shí)打開排氣閥門，排凈其中冷空氣，否則壓力表上所示壓力并非全部是蒸汽壓力，滅菌將不完全。待冷空氣全部排出后（即水蒸氣從排氣閥中屈瀆誹八穴口門廿入卩勺。處決如股，待壓力表漸漸升至所需壓力時(shí)（一般是101.53kPa,即15磅/英寸，溫度為121.3C）,保持壓力和溫度（注意壓力不要過大，以免發(fā)生意外），維持1530mine滅菌時(shí)間到達(dá)后，停止加熱,待壓力降至零時(shí)，慢慢打開排氣閥

43、,排除余氣，開蓋取物。切不可在壓力尚未降低為零時(shí)突然打開排氣閥門，以免滅菌器中液體噴出。高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點(diǎn)有三：一、濕熱滅菌時(shí)菌體蛋白容易變性，二、濕熱穿透力強(qiáng)，三、蒸氣變成水時(shí)可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。凡耐高溫和潮濕的物品，如培養(yǎng)基、生理鹽水、衣服、紗布、棉花、敷料、玻璃器材、傳染性污物等都可應(yīng)用本法滅菌。注意事項(xiàng)：第一，無菌包不宜過大（小于50cmX30cmX30cm）,不宜過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。消毒前，打開貯槽或盒的通氣孔，有利于蒸汽流通。而且排氣時(shí)使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒滅菌完畢，關(guān)閉貯槽或盒的

44、通氣孔，以保持物品的無菌狀態(tài)。第二，布類物品應(yīng)放在金屬類物品上，否則蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻礙蒸汽進(jìn)入包裹中央，嚴(yán)重影響滅菌效果。第三，定期檢查滅菌效果。經(jīng)高壓蒸汽滅菌的無菌包、無菌容器有效期以1周為宜。干熱與濕熱滅菌雖然都是利用熱的作用殺菌，但由于本身的性質(zhì)與傳導(dǎo)介質(zhì)不同，所以其滅菌的特點(diǎn)亦不一樣（表1）。圖6煮沸消毒器圖5-3手提高圧蒸氣滅菌器煮沸法將水煮沸至100C,保持510分鐘可殺滅繁殖體，保持13小時(shí)可殺滅芽胞。在水中加入碳酸氫鈉至12%濃度時(shí)，沸點(diǎn)可達(dá)105C,能增強(qiáng)殺菌作用，還可去污防銹。在高原地區(qū)氣壓低、沸點(diǎn)低的情況下，要延長消毒時(shí)間（海拔每增高300m,需延長消毒

45、時(shí)間2分鐘）。此法適用于不怕潮濕耐高溫的搪瓷、金屬、玻璃、橡膠類物品。圖5-2口動(dòng)高圧蒸氣滅菌器4.電熱烤箱：利用烤箱的熱空氣消毒滅菌?？鞠渫娂訜岷蟮目諝庠谝欢臻g不斷對流，產(chǎn)生均一效應(yīng)的熱空氣直接穿透物體。一般繁殖體在干熱80100C中經(jīng)1小時(shí)可以殺死，芽胞、病毒需160170C經(jīng)2小時(shí)方可殺死。熱空氣消毒滅菌法適用于玻璃器皿、瓷器以及明膠海棉、液體石臘、各種粉劑、軟膏等。滅菌后待箱內(nèi)溫度降至5040C以下才能開啟柜門，以防炸裂表一、干熱滅菌與濕熱滅菌的比較加熱介質(zhì)對物品影響適用對象作用溫度作用時(shí)間殺菌能力干熱濕熱空氣水和蒸汽烤焦濡濕（皮革損壞）低（60134C）短（460分鐘）較強(qiáng)金屬、

46、玻璃與其他不畏焦化物品棉織品、水液等不畏濕熱物品高（160400C）長（15小時(shí)）較差輻射消毒滅菌包括光照消毒和電離輻射。光消毒主要是利用紫外線照射，其殺菌作用主要是因?yàn)镈NA吸收了紫外線引起胸腺卩密噪形成二聚體，從而干擾了DNA的復(fù)制，輕則發(fā)生突變，重則導(dǎo)致死亡。紫外線通過空氣時(shí)，可使空氣中的氧氣電離產(chǎn)生臭氧，加強(qiáng)了殺菌作用。紫外線穿透性差，不能透過玻璃，塵埃，紙張和固體物質(zhì)；透過空氣能力較強(qiáng)，透過液體能力很弱。光照消毒對桿菌殺菌力強(qiáng)，對球菌較弱，對霉菌、酵母菌更弱。對生長期細(xì)菌敏感，對芽胞敏感性差。光照消毒因地區(qū)、季節(jié)、環(huán)境的影響，效果有所差異，當(dāng)溫度低于4C,濕度超過50%時(shí)，殺菌能力減

47、弱。因此，消毒時(shí)必須提高溫度，延長消毒時(shí)間，一般室溫保持在1025C為宜。減少空氣中的塵埃，直接照射物品，可提高消毒的效果。（1）日光曝曬法：日光由于其熱、干燥和紫外線作用，具有一定的殺菌力，將物品放在直射日光下，曝曬6小時(shí)，定時(shí)翻動(dòng)，使物體各面均受日光照射。此法多用于被褥、床墊、毛毯、書籍等物品的消毒。（2）紫外線燈管消毒法：紫外線因其光譜位于紫色可見光之外，故稱紫外線。紫外線燈管是一種人工制造的低壓汞石英燈管，管內(nèi)注入壓強(qiáng)0.40.6kPa的氮?dú)夂退y數(shù)滴，管子兩端用鵠絲作成螺旋狀電極。通電后，氮?dú)庀入婋x，然后沖擊水銀電離，發(fā)放紫外線。經(jīng)57分鐘后受紫外線照射的空氣，才能使氧氣產(chǎn)生臭氧。因

48、此消毒時(shí)間應(yīng)從燈亮57分鐘后計(jì)時(shí)，紫外線殺菌能力與其波長有密切關(guān)系。最佳殺菌波長為2537nm（是細(xì)菌對紫外線吸收最快的波長）。常用的紫外線燈管有15W、20W、30W、40W四種，可釆用懸吊式，移動(dòng)式燈架照射，或紫外線消毒箱內(nèi)照射。紫外線燈配用拋光鋁板作反向罩，可增強(qiáng)消毒效果。用于物品消毒時(shí)，如選用30W紫外線燈管，有效照射距離為2560cm,時(shí)間為2530分鐘（物品要攤開或掛起，擴(kuò)大照射面）。用空氣消毒時(shí)，室內(nèi)每10m2安裝30W紫外線燈管1支，有效距離不超過2m。照射時(shí)間為3060分鐘，照射前清掃塵埃，照射時(shí)關(guān)閉門窗，停止人員走動(dòng)。注意事項(xiàng)：注意眼睛、皮膚的保護(hù)，照射時(shí)囑病人勿直視紫外線

49、光源，可戴墨鏡,或有用紗布遮蓋雙眼。用被單遮蓋肢體，以免引起眼炎或皮膚紅斑。紫外線燈管要保持清潔透亮。燈管要輕拿輕放。關(guān)燈后應(yīng)間隔34分鐘后才能再次開啟。一次可連續(xù)使用4小時(shí)。定期監(jiān)測消毒效果。紫外線的殺菌力取決于紫外線輸出量的大小，燈管的輸出強(qiáng)度隨使用時(shí)間的增加而減弱。故日常消毒多采用紫外線強(qiáng)度計(jì)或化學(xué)指示卡進(jìn)行監(jiān)測，新管（30W）不低于100uW/cm2；使用中的舊管在50-70uW/cm2，則需延長消毒時(shí)間；低于50uW/cm2者必須更換。定期進(jìn)行空氣細(xì)菌培養(yǎng)，以檢查殺菌效果。（3）臭氧滅菌燈（電子滅菌燈）消毒法滅菌燈內(nèi)裝有14支臭氧發(fā)生管，在電場作用下，將空氣中的氧氣轉(zhuǎn)換成高純臭氧。臭

50、氧主要依靠其強(qiáng)大的氧化作用而殺菌。使用滅菌燈時(shí)，關(guān)閉門窗，確保消毒效果。用于空氣消毒時(shí)，人員須離開現(xiàn)場，消毒結(jié)束后2030分鐘方可進(jìn)入。6、除菌濾器除菌濾器簡稱濾菌器。種類很多，孔徑非常小，能阻擋細(xì)菌通過。它們可用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃屑等制成。下面介紹幾種常用的濾菌器。（1）結(jié)構(gòu):圖3-2塞氏濾菌器賽氏（Seitz）濾菌器（圖7）：由三部分組成。上部的金屬圓筒，用以盛裝將要濾過的液體；下部的金屬托盤及漏斗，用以接受濾出的液體；上下兩部分中間放石棉濾板，濾板按孔徑大小可分為三種：K濾孔最大，供澄清液體之用；EK濾孔較小，供濾過除菌；EKS濾孔更小，可阻止一部分較大的病毒通過。濾板依靠側(cè)面附帶

51、的緊固螺旋擰緊固定。玻璃濾菌器（圖8-1）：由玻璃制成。濾板采用細(xì)玻璃砂在一定高溫下加壓制成?？讖接?.15250um不等,分為G】、&、Gs、GhGsGs六種規(guī)格，后兩種規(guī)格均能阻擋細(xì)菌通過。薄膜濾菌器（圖8-2）：由塑料制成。濾菌器時(shí)nx木AtriAJ貝打年f応級，巾一定工藝加壓制成。孔徑：200nm,能阻擋細(xì)菌通過。圖3-3玻璃琵器與使用時(shí)的過濾裝送圖3-4傅脫施菌器（2）用法：將清潔的濾菌器（賽氏濾菌器和薄膜濾菌器須先將石棉板或?yàn)V菌薄膜放好,擰牢螺旋）和濾瓶分別用紙或布包裝好，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。再以無菌操作把濾菌器與濾瓶裝好，并使濾瓶的側(cè)管與緩沖瓶相連，再使緩沖瓶與抽氣機(jī)相連。將待

52、濾液體倒入濾菌器內(nèi)，開動(dòng)抽氣機(jī)使濾瓶中壓力減低，濾液則徐徐流入濾瓶中。濾畢，迅速按無菌操作將濾瓶中的濾液放到無菌容器內(nèi)保存。濾器經(jīng)高壓滅菌后，洗凈備用。（3）用途：用于除去混雜在不耐熱液體（如血清、腹水、糖溶液、某些藥物等）中的細(xì)菌。超聲波消毒法是利用頻率在20200kHz的聲波作用下，使細(xì)菌細(xì)胞機(jī)械破裂和原生質(zhì)迅速游離，達(dá)到消毒目的。如超聲洗手器，用于手的消毒。超聲洗滌機(jī)，用于注射器的清潔和初步的消毒處理。（二）常見化學(xué)消毒滅菌劑介紹（種類見醫(yī)學(xué)微生物學(xué)）化學(xué)消毒滅菌劑的使用原則（1）根據(jù)物品的性能及病原體的特性，選擇合適的消毒劑。（2）嚴(yán)格掌握消毒劑的有效濃度、消毒時(shí)間和使用方法。（3）需

53、消毒的物品應(yīng)洗凈擦干，浸泡時(shí)打開軸節(jié)，將物品浸沒于溶液里。（4）消毒劑應(yīng)定期更換，揮發(fā)劑應(yīng)加蓋并定期測定比重，及時(shí)調(diào)整濃度。（5）浸泡過的物品，使用前需用無菌等滲鹽水沖洗，以免消毒劑刺激人體組織。常用化學(xué)消毒滅菌方法（1）浸泡法：選用殺菌譜廣、腐蝕性弱、水溶性消毒劑，將物品浸沒于消毒劑內(nèi)，在標(biāo)準(zhǔn)的濃度和時(shí)間內(nèi)，達(dá)到消毒滅菌目的。（2）擦拭法：選用易溶于水、穿透性強(qiáng)的消毒劑，擦拭物品表面，在標(biāo)準(zhǔn)的濃度和時(shí)間里達(dá)到消毒滅菌目的。（3）薰蒸法：加熱或加入氧化劑，使消毒劑呈氣體，在標(biāo)準(zhǔn)的濃度和時(shí)間里達(dá)到消毒滅菌目的。適用于室內(nèi)物品及空氣消毒或精密貴重儀器和不能蒸、煮、浸泡的物品（血壓計(jì)、聽診器以及傳染

54、病人用過的票證等），均可用此法消毒。純?nèi)樗幔撼Ｓ糜谑中g(shù)室和病室空氣消毒。每100n?空間用乳酸12ml加等量水，放入治療碗內(nèi)，密閉門窗，加熱熏蒸，待蒸發(fā)完畢，移去熱源，繼續(xù)封閉2小時(shí)，隨后開窗通風(fēng)換氣。食醋：510ml/m3加熱水12閉門加熱熏蒸到食醋蒸發(fā)完為止。因食醋含5%醋酸可改變細(xì)菌酸堿環(huán)境而有抑菌作用，對流感、流腦病室的空氣可進(jìn)行消毒。此外，尚可應(yīng)用甲醛或過氧乙酸等進(jìn)行熏蒸滅菌。（4）噴霧法：借助普通噴霧器或氣溶膠噴霧器，使消毒劑產(chǎn)生微粒氣霧彌散在空間,進(jìn)行空氣和物品表面的消毒。如用1%漂白粉澄清液或0.2%過氧乙酸溶液作空氣噴霧。對細(xì)菌芽胞污染的表面，每立方米噴霧2%過氧乙酸溶液8m

55、l經(jīng)30分鐘（在18C以上的室溫下），可達(dá)99.9%殺滅率。（5）環(huán)氧乙烷氣體密閉消毒法：將環(huán)氧乙烷氣體置于密閉容器內(nèi)，在標(biāo)準(zhǔn)的濃度、濕度和時(shí)間內(nèi)達(dá)到消毒滅菌目的。（三）藥物敏感試驗(yàn)（紙片法）用光頭棉簽沾取大腸桿菌或葡萄球菌培養(yǎng)6小時(shí)的菌液，密集地涂布于普通瓊脂平板培養(yǎng)基上。用平頭錫經(jīng)火焰滅菌，待冷后夾取各種抗生素紙片分別貼于涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面（若抗生素紙片未印字，須于乎板底面注上抗生素名稱），置37C溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察結(jié)果。觀察結(jié)果若大腸桿菌或葡萄球菌對某種抗生素敏感，則在該抗生素紙片周圍有一圈無細(xì)菌生長的區(qū)域，稱抑菌圈。測量抑菌圈直徑的大小，查表即可得出細(xì)菌對該藥物的敏感度（表

56、-2）。表-2紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果讀取表抗菌藥物抑菌圈直徑(mm)耐藥中度敏感敏感青9葡萄球菌W202廣28220素G其他細(xì)菌W111221$22鏈霉素W111214$15磺胺W1213、16$17慶大霉素W121314$15纖霉素W131417218卡那霉素W131417218【附】一、藥物敏感試驗(yàn)(試管稀釋法)原理：以水解酪蛋白(M-H)液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接種入待檢細(xì)菌，定量測定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度(MBC)。材料：菌種:金黃色葡萄球菌菌液(105CFU/ml)o培養(yǎng)基：MH肉湯，去脂肪筋膜牛肉300g絞碎，加蒸飾水1000m

57、l,制成肉浸液。將可溶性淀粉1.5g水解酪蛋白17.5g加入肉浸液內(nèi)，加熱熔化后調(diào)pH至7.4,15磅/英寸$高壓滅菌15min備用。100u/ml的青霉素鉀鹽方法：取無菌小試管10支排于試管架，于第一管加入MH肉湯1.9ml,210管各加lmlo于第一管加入稀釋好的100u/ml的青霉素鉀鹽0.lml,混勻后取lml加入第2管，依次倍比稀釋，自第9管吸出lml棄去，第10管為對照管(表31)。將各管中加入己校正濃度的金黃色葡萄球菌菌液(105cfu/ml)0.05ml,混勻后放置35C培養(yǎng)18h,觀察結(jié)果。表3-1青霉素液稀釋法試管號123456789I0培養(yǎng)墓(ml)1.9你10K你7和1

58、叭八你1.0(ml)0J1.01.01.0L01.01.01.01.0棄去(血)5.002.501.250.630.310.160.080.040.020結(jié)果：確定無細(xì)菌生長的藥物最高稀釋管，該管的濃度即為該菌對此藥物的敏感度，即MICo二、藥物敏感試驗(yàn)（瓊脂稀釋法）（一）原理：瓊脂稀釋法敏感試驗(yàn)是將不同劑量的抗菌藥物，分別加入融化并冷至45C的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，制成無菌平板，即為所含藥物濃度遞減的培養(yǎng)基。接種幼齡菌于該培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察被檢菌的生長情況，抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該抗生素對該菌的最低抑菌濃度。（二）材料：菌種：金黃色葡萄球菌菌液（10sCFU/ml）o培養(yǎng)基：水解

59、酪蛋白（MHA）培養(yǎng)基（MH肉湯1000ml,調(diào)pH值后，加17g瓊脂,分裝后15磅/英寸？高壓滅菌15min備用）?？咕幬镌海?280ug/ml）o麥?zhǔn)媳葷峁?，校正待檢菌濃度用。（三）方法：制備含藥瓊脂平板：將藥液倍比稀釋，至15個(gè)不同濃度，用15個(gè)無菌90mm平皿分別加各個(gè)濃度的抗生素2ml于其中，再加入45CMH瓊脂18ml,充分混勻，冷卻凝固（接種前平板必須相當(dāng)干燥）。取己校正濃度的待檢菌液（10sCFU/ml）接種于含藥瓊脂的表面，操作時(shí)從最低濃度的瓊脂種起，使每滴約2口1菌液，每一接種點(diǎn)的液滴直徑為58mm,注意勿使移動(dòng),待接種點(diǎn)干燥后，再將平板翻轉(zhuǎn)，置35C孵箱內(nèi)孵育1624

60、h觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：不出現(xiàn)菌落的瓊脂平板上的最低藥物濃度為其最低抑菌濃度。結(jié)果可用藥物的濃度報(bào)告。若超過抑菌終點(diǎn)仍有數(shù)個(gè)明顯菌落，應(yīng)考慮試驗(yàn)菌的純度而予以復(fù)試，如僅為單個(gè)菌落，可予以忽略。判定時(shí)應(yīng)注意：薄霧狀生長不算；5個(gè)菌落不算；若在數(shù)個(gè)平板上呈拖尾或跳管生長等現(xiàn)象，應(yīng)該重做。三、藥物敏感試驗(yàn)（E試驗(yàn)）（一）原理：E試驗(yàn)（Etest）是一種定量的抗生素藥敏測定技術(shù)，此試驗(yàn)是稀釋法和擴(kuò)散法原理的結(jié)合產(chǎn)物，可用于在瓊脂培養(yǎng)基上判定某抗生素對微生物的最小抑菌濃度（MIC）,用ug/ml表示。E試驗(yàn)?zāi)苡眠B續(xù)的MIC數(shù)值直接對抗生素的藥敏定量。由于E試驗(yàn)MIC值都來自一個(gè)預(yù)先制備且連續(xù)的抗生素濃度梯