角膜整鋪片免疫熒光染色protocol

1、角膜整鋪片免疫熒光染色protocol實(shí)驗(yàn)器材：手術(shù)顯微鏡（Topcon OMS-90）, 4C冰箱角膜剪1把，無齒顯微鑷2把，90mm玻璃平皿，11#手術(shù)刀片2個，1.5mlEP管，EP管架、 棉簽，記號筆，移液器（規(guī)格1ml,100ul,10ul各一把，Gilson），無菌槍頭（規(guī)格1ml,100ul,10ul）、 10ml無菌玻璃瓶和橡膠塞，50mL燒杯，一次性塑料吸管，封口膜，清潔載玻片，0.17um 清潔蓋玻片，吸水濾紙，避光片盒、記錄紙筆。實(shí)驗(yàn)試劑：1、D-PBS （Kcl 0.2g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4- 12H2O 2.8976g,Nacl 8g,D-Gluc

2、ose 1g 溶解于1000ml注射用水，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4）2、TritonX-100（solarbio）（平常配制成 10%儲備液，9mlD-PBS+1mlTritonX-100, 保存于4C冰箱，臨用前用2%BSA稀釋成0.2%Triton-BSA）3、BSA （Roche分裝）（可配制成2%BSA溶液：稱取2gBSA粉末溶解于 100mlD-PBS溶液內(nèi)，完全溶解后分裝至10ml玻璃瓶內(nèi)，每瓶5ml，封口標(biāo)記后凍存于-21C 備用，臨用前溶解即可）4、固定液：4%多聚甲醛（稱取4g多聚甲醛固體溶解于100mlD-PBS溶液內(nèi)，60C 水浴促溶，完全溶解后封口標(biāo)記，保存于4C冰箱備用

3、，2周內(nèi)使用）后來張老師查資料， 不宜放置4C冰箱，否則會有析出，室溫放置即可。使用之前4C預(yù)冷。AF固定液（95%乙醇90ml+甲醛原液10ml，易揮發(fā)，注意密封，保 存于4C冰箱備用，2周內(nèi)使用）2%甲醛（甲醛原液濃度為37%-40%，用D-PBS將其稀釋成2%，封 口標(biāo)記，保存于4C冰箱，2周內(nèi)使用）后來張老師查資料，不宜放置4C冰箱，否則會有 析出，室溫放置即可。使用之前4C預(yù)冷。抗體染液：臨用現(xiàn)配。冰盒上而操作，加之前反復(fù)吹打DAPI （invitrogen 10mg/ml， 用 D-PBS先將其稀釋成100ug/ml的儲備液，臨用前 用D-PBS稀釋成1ug/ml即可）CFW染液：

4、（FLUKA公司名，為10%CFW，臨用前用D-PBS稀釋成0.1%即可） 熒光封片膠（sigma）實(shí)驗(yàn)操作：1、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)器械和4C預(yù)冷的D-PBS和固定液，向1.5mlEP管內(nèi)加滿4C預(yù)冷的固定液， 向90mm的玻璃平皿內(nèi)倒入4。預(yù)冷的D-PBS或固定液。2、取材：將小鼠脫頸椎處死，在手術(shù)顯微鏡下，暴露眼球，用刀片自靠近操作者的一側(cè)沿 角膜緣稍偏下（以免角膜緣保留不全）的部位向前平行刺入，將眼球平切一半，再用角膜剪 剪取角膜，置于玻璃平皿內(nèi)，左右眼放入不同的平皿內(nèi)。剔除晶體、虹膜等非角膜組織，只 保留完整的角膜和角膜緣。（取材最好在冰上操作）8只，約2h可以將眼球固定在AF中過夜，在PBS中

5、修剪，之后修剪再放入PBS3、固定:用D-PBS沖洗角膜表面殘留的血液或毛發(fā)后，將其置于盛有固定液的EP管內(nèi)，4C， 固定30min-2h。（角膜放入EP管，務(wù)必保證角膜呈自然的“碗狀”，否則，固定之后，角膜 硬度增加，切片時不易展平）4、沖洗：倒去EP管內(nèi)的固定液，向EP管內(nèi)加滿4C預(yù)冷的D-PBS，快速沖洗一遍，再繼 續(xù)用D-PBS沖洗5遍，每遍10min。（沖洗時，可輕輕顛倒EP管，使沖洗效果更佳；沖洗 時可將D-PBS倒入50mL小燒杯內(nèi)，避免直接從玻璃瓶反復(fù)吸取，污染溶液）5、配制0.2%Triton-BSA，置于4C冰箱備用。取出凍存于-21C冰箱的2%BSA置于室溫溶 解，溶解后

6、保存于4C冰箱。預(yù)先完成？ ？6、破膜：沖洗完畢，倒去EP管內(nèi)的D-PBS，殘留的D-PBS可用移液器吸掉，用1ml移液 器向管內(nèi)加入200ul0.2%Triton-BSA，浸沒角膜組織。將EP管置于4C冰箱，30min。7、封閉：破膜結(jié)束，倒去EP管內(nèi)的0.2%Triton-BSA，用移液器吸取2%BSA溶液200ul加至EP管內(nèi)浸沒角膜組織。將EP管置于4C冰箱，30 min。8、配制抗體染液（常用抗體濃度及固定液見附1）9、抗體孵育：更換EP管并做好相應(yīng)標(biāo)記，向每個EP管內(nèi)加入50ul抗體染液，用錫箔紙 包裹EP管，再用無齒顯微鑷將角膜組織從原來的EP管中取出置于新的有相應(yīng)標(biāo)記的EP 管

7、內(nèi)。確保角膜浸于抗體染液中。將EP管置于4C冰箱，過一夜（按12h計(jì)算）。.明天操作10、沖洗：更換EP管，向新的EP管內(nèi)加滿D-PBS并做好相應(yīng)標(biāo)記，用錫箔紙包裹EP管， 用無齒顯微鑷將角膜組織從抗體染液中取出置于D-PBS溶液中，輕輕顛倒EP管，快速沖洗 一遍，繼續(xù)用D-PBS沖洗5遍，每遍10min。（將抗體染液保存于4C冰箱，有些抗體可以 重復(fù)使用）11、配制0.1%CFW染液。12、CFW染色：沖洗完畢，倒去D-PBS溶液，向EP管內(nèi)加入100ul 0.1%CFW染液，室溫， 染色10min。13、沖洗：同步驟4。棄CFW14、配制 1ug/ml DAPIo15、DAPI復(fù)染：沖洗完

8、畢，倒去D-PBS，向EP管內(nèi)加入50ul 1ug/ml DAPI染液，4。，染 色 30min.。16、沖洗：同步驟4。棄DAPI17、整鋪片：取出角膜，置于清潔載玻片（載玻片，有磨砂面向上）上，在角膜組織上滴- 滴D-PBS溶液，使角膜不易粘連，易維持自然舒張狀態(tài)。用無齒顯微鑷協(xié)助使角膜上皮面 向上，用刀片將角膜切成4瓣，但使角膜中央相連接，輕輕展平角膜組織，用吸水濾紙吸掉 角膜周圍多余的水分，但不能使角膜干掉。滴一滴封片膠，從一端輕輕蓋上蓋玻片。將片子 置于干燥避光處保存，待封片膠晾干用塑料袋包裹片盒再置于4C冰箱保存，長時間保存可 置于-21C附1：實(shí)驗(yàn)室常用抗體抗體名稱公司固定液常用濃度PE CD31 （血管）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+5ulFITC Gr-1 （中性粒）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+3ulPE CD3eeBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+6ulFITC CD80李志杰教授提供AF600ul0.2%Triton-BSA+0.1ulPE yT）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+6ulPE CD41eBioscience2%甲醛300ul 0.2%Triton-BSA+6ulAlexa fl