腫瘤細胞培養(yǎng)與雜交瘤技術

1、關于腫瘤細胞培養(yǎng)和雜交瘤技術第一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、腫瘤細胞體外培養(yǎng)的重要性 惡性腫瘤細胞培養(yǎng)建立細胞系，包括癌細胞系和轉化細胞系。轉化細胞系可以是惡性轉化細胞和一般轉化細胞兩種。第二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月惡性轉化細胞系和癌細胞系一樣具有永久性生長能力和惡性表型，對此二種來源的細胞系鑒定也是相似的，為研究惡性腫瘤提供了有用模型。而一般轉化細胞系只具有無限生長能力，不具有惡性細胞的表型，此種細胞系可相似于正常細胞的模型而被應用。第三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細胞來源于體內正常上皮細胞。癌細胞在體內或體外一樣具有無控制生長和分化

2、不全的特點，因此比正常細胞容易培養(yǎng)建細胞系。如20世紀50年代，國外建立了宮頸癌的Hela細胞系。第四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細胞的增殖是按指數方式生長的，自一個癌細胞增殖到能觸及的程度要經過30代（109，1cm3, 1g）。這樣1cm3大小的腫塊再經過10代（ 1012 ，10 cm3，1Kg）。這樣的大小和重量時足以致病人于死亡。經治療后如細胞數從1012減少至1010，重約10g時可稱顯效或部分緩解；若腫瘤細胞數減少到108或106，重約100mg至10mg時，可認為臨床治愈或完全緩解，但仍有可能復發(fā)。要根治腫瘤細胞，必須徹底消滅所有癌細胞。外科手術切除大量腫瘤細

3、胞，但轉移癌細胞仍有復發(fā)的危險。第五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細胞的迅速增殖擴散受機體內環(huán)境中多種因素的影響如各種生長因子、抑素、激素、多胺、基因調節(jié)包括細胞周期基因和癌基因、cAMP和cGMP濃度（前者對細胞增殖負調節(jié)，而后者為相反）。第六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月正常細胞周期的G1期有一個特殊的調節(jié)點R點，在生長條件不適宜情況下，細胞不能通過調節(jié)點而不增殖，細胞通過G1期進入M期前受一種不穩(wěn)定蛋白質調節(jié)通過R點啟動DNA的合成，例如抑癌基因P53最重要的生物學功能就是通過調控細胞周期監(jiān)測點來維持基因組的穩(wěn)定性，當細胞DNA受損時，P53誘導細胞周期終止

4、或凋亡，而P53突變或缺失使P53功能失活則導致基因組紊亂，產生細胞轉化。第七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月體內細胞處于不同狀態(tài)，大概分成三種命運:繼續(xù)增殖細胞，不斷離開G1期通過細胞周期中不同時期（S 、G2、M）完成細胞分裂，如骨髓干細胞，胃腸上皮中的基底細胞等，不增殖細胞，這類細胞在分裂完成后，暫處于G1期，正常情況下不合成DNA，不進入細胞分裂期，如肝細胞，只有受損或切除時肝細胞再分裂增殖。哺乳動物的初級卵細胞也屬于此類。不增殖細胞，這類細胞由R點走向分化細胞，并執(zhí)行專門功能的細胞（稱終末細胞）如神經細胞、哺乳動物成熟的紅細胞、皮膚上皮的角質細胞、多性核粒細胞。 第八張，

5、PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤和正常的組織同樣在體內也具有三種不同的細胞群：增殖細胞群（A）：是腫瘤中處于增殖周期的細胞，與腫瘤生長直接有關，亦是化學療法最易攻擊的部分。第九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月暫不增殖細胞群（B），它是延長了G1細胞或G0細胞，目前不參加細胞周期，與腫瘤的擴大暫時無關，由于它保留著增殖的能力，在一定條件下成為腫瘤復發(fā)根源。第十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月不再增殖群（C），它不再參與細胞周期，而日趨衰老，死亡，對腫瘤增長無意義。腫瘤的增長情況取決于3種細胞群的比例，腫瘤增殖率（growth factor GF）可由下列關系來

6、決定：GF=AA+B+C。A群細胞越多， B、C群細胞越少，腫瘤惡性程度越高。第十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月常應用體外腫瘤細胞培養(yǎng)，模擬體內環(huán)境或確定單因素多因素研究腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展結局。觀察抗癌藥物對細胞周期作用點的影響也常應用腫瘤細胞體外培養(yǎng)。若能確定腫瘤細胞各周期時間，選擇各期針對性藥物進行治療，則可以提高療效。第十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月放線菌素D作用于G1期抑制DNA聚合酶合成，作用于S后期與G2期抑制rRNA并影響cAMP水平。放線菌素D不影響非分裂期細胞，因而放線菌素D是一種細胞周期特異性藥物。第十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022

7、年6月阿糖胞嘧啶，選擇性地抑制核苷二磷酸還原酶，阻斷核苷酸變?yōu)槊撗鹾塑账幔瑥亩种艱NA合成，是DNA合成抑制劑，屬于S期特異性藥物。第十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月秋水仙素能與微管蛋白強烈結合，引起微管解體，紡錘體破壞，結果染色體的移動被阻斷，細胞分裂停留在中期，它是屬于M期的特異性藥物。通過體外細胞培養(yǎng)觀察抗癌藥物對細胞周期作用點將常用的抗癌藥物的細胞周期分類。第十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月數十年來醫(yī)生們除用手術外只能用放療和化學療法來治療癌癥，這些療法毫無分別地同時殺死健康細胞和癌細胞，直到人類基因組圖譜的解密，我們才迎來了適用少數病人的靶向性治療新

8、時代，醫(yī)生們首先分析病人腫瘤中的DNA（基因），再開出靶向性復合藥物的藥方，專門攻擊腫瘤細胞發(fā)生缺陷的基因，達到治療癌癥的目的。第十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當前較有前景的靶向治療現在發(fā)展的基因工程腺病毒（ONYX-015）因刪除了E1B 55KD蛋白而可以選擇性的溶解P53突變或缺失的腫瘤細胞，此類腫瘤細胞占50，也就是腺病毒ONYX-015可達到50的靶向治療藥物的效果，目前已在頭頸部腫瘤中進行期臨床試驗。第十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當前較有前景的靶向治療腫瘤對化療和放療抗性的一種機制是由于P53突變或P53的缺失，人類癌50 % P53突變Non

9、 small cell lung 60 %Colon 50 %Breast 40 %Head and neck 60 %Ovarian 60 %第十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月制備單克隆抗體，主要是靶向表皮生長因子EGF受體EGFR和HER-2。80年代研究人員發(fā)現，在人類的腦部、肺部和胰腺等部位的腫瘤中EGFR的含量極高，Artrazeneca公司的研究人員于1998年率先提出通過開發(fā)阻斷EGFR的藥物，可以抑制腫瘤的生長，這種全新的療法就是現在的靶向性療法，它沒有毒副作用，不會殺死正常細胞，按照這種思路，基因技術公司開發(fā)出一種治療晚期乳腺癌的藥物Herceptin，并于1

10、998年獲準上市。Herceptin是一種單克隆抗體藥物，靶向HER-2，這種藥物能使只有5個月壽命的晚期乳腺癌病人繼續(xù)生存。為什么Herceptin成功獲準，由于臨床試驗中沒有同時對所有乳腺癌患者進行試驗，而是選擇了其中的一小部分（大約占25）的那些HER-2含量異常高的晚期乳腺癌患者。第十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月Astrazeneca公司的肺癌藥Iressa等都是靶向藥物，靶EGFR，但成功的只有Herceptin。Iressa只在10肺癌患者中有神奇作用，但在大規(guī)模的臨床試驗中90人無效?；?億美元，10年時間，未獲批準。第二十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022

11、年6月腫瘤發(fā)生發(fā)展結局的機理研究進入分子水平，人類最終認識腫瘤才可以征服腫瘤。若癌變 的始發(fā)變化是基因活動的調控失常，癌變就具有潛在的可逆行，就可以為腫瘤治療開辟一個完全新的途徑控制調控機制；若癌變的本質是基因突變，那就意味著癌變不可逆，只有了解其突變的部位，只有通過基因治療，而所有這種機理的研究，其中一個重要的手段是通過腫瘤細胞的體外培養(yǎng)進行研究。雖然體外培養(yǎng)不能完全反映體內情況，但為單因素、多因素研究提供模型。第二十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月由于機體內環(huán)境是復雜的，每個人影響腫瘤細胞形成因素復雜，在應用單克隆抗體治療肺癌病人過程中發(fā)現對每個人的療效不一致，這就需要開創(chuàng)個

12、體化抗腫瘤治療的研究，而開展個t體化抗腫瘤治療的基礎，首先將每個病人的腫瘤細胞特征（如腫瘤抗原表達）細胞因子的作用，抗癌藥物的篩選，進行研究，這是一個巨大的工作，不是一兩個人能完成，需要有一個群體共同協(xié)作完成，前后期研究人員通力合作才可完成。第二十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、癌細胞系的建立 癌細胞來源于體內正常上皮細胞。癌細胞在體外和體內一樣具有無控制生長和分化不全的特點，因此比正常細胞容易培養(yǎng)和建系。早在20世紀50年代，國外建立宮勁癌的Hela細胞系以來，隨著細胞培養(yǎng)和技術的改進，人各種器官組織來源的癌細胞系不斷問世，國外已建立很多癌細胞系。第二十三張，PPT共一百二

13、十頁，創(chuàng)作于2022年6月盡管癌細胞在體外較容易存活和建系，但仍存在一定困難。最主要的問題是從體內到體外環(huán)境的改變，阻斷了癌細胞在體內從周圍正常間質組織和血管獲取癌細胞生長最適營養(yǎng)（包括生長因子），及間質細胞過度生長，耗竭了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。隨著組織培養(yǎng)技術的改進，特別是培養(yǎng)基的改進，促進了癌細胞建系的成功。 第二十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）癌細胞原代培養(yǎng)癌細胞建系的方法和程序相似于正常細胞，包括標本收集和處理、消化和培養(yǎng)、傳代、換液、凍存、復蘇等過程。針對癌細胞特點有以下改進內容。第二十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1標本收集和取材 癌細胞是異質性

14、的，因此取癌組織最外層組織最活躍細胞，同時要注意除去標本中混雜的間質組織。第二十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月為了克服癌細胞群體的異質性，在原代培養(yǎng)取材時可考慮采用轉移灶標本，如轉移的淋巴結、癌性胸腹水等。轉移組織中的癌細胞已經經過生長優(yōu)勢選擇，群體細胞比較均一，增殖細胞群比腫瘤細胞更易于生長。取材后盡快將癌組織進行培養(yǎng)，一般4小時內細胞存活最好。標本在4存放，不要超過24小時。第二十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月人癌細胞建系必須要有完整的記錄，包括組織來源、病人姓名、住院號、年齡、性別、臨床診斷、病理診斷（應明確分類分期）、術前放化療情況，為細胞建系的重要材料

15、。為了鑒定建立的細胞系來源和生物學特性，最好留有病人正常組織和血標本。第二十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2分散癌組織 癌組織多為較堅實實體（少數例外，如卵巢癌、腦癌），含有豐富的間質細胞，因此用酶消化癌組織，是分散癌細胞的好的方法。少數含結締組織不多的癌組織可選用機械分散的方法。機械分散對癌細胞損傷小，但有過多的纖維細胞從結締組織中離散出來。 第二十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月胰蛋白酶(trypsin)是最常應用的酶，但它對結締組織的消化能力有限，適合含結締組織較少的腫瘤，并且trypsin對細胞膜有損害作用，影響細胞存活。膠原酶消化癌組織證明更有效，可抑制

16、結締組織細胞的生長。膠原酶的消化方法：0.5mgml膠原酶處理，可在顯微鏡下觀察，纖維細胞逐漸被除去為止。用Hanks液或培養(yǎng)基洗滌，除去附著細胞的酶，再進行接種和培養(yǎng)。第三十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當腫瘤組織標本很小，不能用酶消化獲取癌細胞時，可以用組織塊法進行原代培養(yǎng)。體內惡性腫瘤呈外向浸潤生長，腫瘤過快，使腫瘤中心組織呈壞死，因此取材時應避開這部分。但癌組織中不可避免有已經耗竭和壞死的細胞，因此在酶消化組織前，應盡可能清除這些細胞，以免接種后很快溶解破壞，釋放出影響癌細胞生長的有害物。第三十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3接種腫瘤細胞 trypsin消

17、化或collagenase消化的腫瘤組織制備的癌細胞，應有足夠的細胞密度，通常接種細胞濃度為5105ml，37培養(yǎng)，通常3周左右可見飼養(yǎng)層上有集落生長。第三十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4成纖維細胞過度生長的去除 上面已介紹了癌組織中成纖維細胞過度生長對癌細胞生長和建系有影響。用選擇培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層等方法可以克服其過度生長?？蓱靡韵路椒ǎ旱谌龔?，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）機械排除法：將玻璃吸管前端在火焰上燒彎曲，用作除去成纖維細胞的工具?？稍陲@微鏡下直接刮除生長的成纖維細胞，也可事先在顯微鏡下對有成纖維細胞生長的單層培養(yǎng)瓶上做出標記，然后按標記刮除。刮

18、除后，用培養(yǎng)液洗12次后，加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)。如需要可多次刮除。第三十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）反復貼壁：根據腫瘤細胞與成纖維細胞貼壁快慢的差異，可以把兩種細胞分開。用消化酶消化細胞，接種到培養(yǎng)瓶后，加入培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶（A）放置371020分鐘左右，將培養(yǎng)上清倒到另一培養(yǎng)瓶（B），加入新培養(yǎng)基，放置371020分鐘，將B瓶上清倒入C瓶，置37培養(yǎng)。將A、B、C瓶與37培養(yǎng)2448小時后于顯微鏡下觀察，將含有成纖維細胞的培養(yǎng)瓶棄去，保留含上皮細胞的培養(yǎng)瓶。如果上皮細胞中仍含有成纖維細胞，可按上述方法繼續(xù)重復處理，直到成纖維細胞去除。第三十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于

19、2022年6月5培養(yǎng)基 在癌細胞建系中，選擇性培養(yǎng)基的應用是提高癌細胞體外存活、抑制成纖維細胞生長的關鍵技術改進。選擇培養(yǎng)基是針對特殊細胞生長的營養(yǎng)要求設計的。針對癌細胞的特點，選擇性培養(yǎng)基應含少量血清。第三十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月血清對上皮細胞有抑制作用有利于成纖維細胞生長。因此用低或無血清培養(yǎng)基為好。改良RPMI-1640培養(yǎng)基可提高癌細胞存活。HITES選擇培養(yǎng)基，加有氫化可的松（hydrocordisone）、胰島素(insulin)、轉鐵蛋白(tramsferrin)、雌激素(estradiol)、硒(selenium)等成分。HITES培養(yǎng)基適合用于人小細胞

20、肺癌建系。Insulin、tramsferrin、selenium、hydrocordisone、EGF、BSA、和丙酮酸鈉（sodium pyruvate）。為了抑制成纖維細胞生長，在培養(yǎng)基中加入成纖維細胞的抗體或成纖維細胞代謝抑制成分，也可提高癌細胞系建系率。第三十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月6飼養(yǎng)層 在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細胞貼壁生長和抑制癌組織中正常成纖維細胞過度生長。第三十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月可以應用多種組織來源的成纖維細胞如人胎小腸細胞、FHS741作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)乳腺癌細胞，小鼠3T3細胞或S

21、TO胚胎成纖維細胞常被應用作飼養(yǎng)層。將trypsin或collagenase消化的腫瘤組織細胞制備的單細胞懸液，接種到形成單層的飼養(yǎng)層細胞上，腫瘤細胞可形成集落，成纖維細胞不形成。第三十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月飼養(yǎng)層的制備將經過放射處理的小鼠3T3細胞接種到培養(yǎng)瓶。材料：無菌3T3細胞，培養(yǎng)基，絲裂霉素C 5ug/ml（無血清培養(yǎng)配制或BSS），X-ray或60Co,30Gy照射。方法：trypsin 消化體外傳代培養(yǎng)的3T3細胞，再以105/ml細胞濃度接種。50%細胞出現匯合，加入0.25ug/ml絲裂霉素C 2ug/106細胞，過夜（或用放射60Co代替）。24小時

22、后換液，trypsin消化細胞，再接種到新培養(yǎng)瓶，每毫升5104細胞加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時作為飼養(yǎng)層。第四十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）癌細胞原代培養(yǎng)的換液和傳代第四十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1換液通常細胞產生酸性代謝產物，培養(yǎng)上清呈黃色（培養(yǎng)瓶中含有酚紅pH指示劑）時，需要及時換液，癌細胞在對數期增殖迅速，每天均需換液，倍增時間較長的細胞可以隔日換一次。第四十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2傳代 原代培養(yǎng)的癌細胞應掌握合適的第二代傳代時間。一般不需要等細胞長到100%匯合才傳代。腫瘤細胞與正常細胞生長特點不同，表現為重疊生長。

23、當在顯微鏡下觀察到上皮樣細胞匯合達50%左右，可見細胞層上堆積有圓形的細胞，指示細胞增殖活躍時就可以傳代。 第四十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月常規(guī)傳代：原代培養(yǎng)物第一次傳代后，需要常規(guī)傳代維持細胞在體外正常生長。細胞象正常細胞一樣在體外 生長可分為潛伏期、對數期和平坦期。盡管各種來源的癌細胞系倍增時間快慢不同，每種細胞系傳代時間有所不同。通常在細胞接種后5天左右傳代一次。一瓶原癌細胞傳到15瓶。如果計數細胞濃度，每瓶可接種（24）105細胞。為建成永久性細胞系需長期傳代達50次以上。第四十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3凍存和復蘇 建立癌細胞系需要在體外進行長

24、期培養(yǎng)和傳代，傳代50次以上才能被認做是永久性細胞系。因此，建系過程需要不斷凍存細胞以防止細胞系中斷。凍存不同傳代次數的細胞液為了提供各種代數的癌細胞為科研應用。體外長期傳代可能引起基因不穩(wěn)定，在細胞表型上發(fā)生改變，影響研究結果。因此，從第一代傳代后，就應盡早地凍存培養(yǎng)物。凍存細胞和復蘇方法與正常細胞相同，可參照正常細胞。第四十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）人肺癌細胞建系人肺癌細胞系的建立。從外科切除的人肺癌標本取材，用胰酶消化組織成單細胞懸液，接種細胞于培養(yǎng)瓶，加入含10%滅活胎牛血清的RPMI1640生長培養(yǎng)基，CO2暖箱37培養(yǎng)。第四十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作

25、于2022年6月1、材料 無菌組織培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)瓶、吸管等。眼科剪刀、鑷子、含攪拌磁棒的玻璃燒瓶。生長培養(yǎng)基：RPMI1640+10%滅活胎牛血清。消化液：0.5%胰蛋白酶（trypsin）+0.04%乙二胺四乙酸二鈉溶液（EDTA），PBS。小型磁力攪拌器。第四十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、方法 從手術切除的肺鱗癌、腺癌、肺泡細胞癌和小細胞癌等標本無菌取腫瘤組織，放入無菌玻璃瓶，立即送實驗室（不需滅菌），每例癌標本有明確記錄，包括患者姓名、性別、年齡、手術時間、病理診斷等。將每種腫瘤組織各放入無菌平皿，去除血塊和壞死組織，用無菌PBS沖洗多次，直到無血跡。轉移各標本到

26、另一平皿中，用無菌小型刀剪從腫瘤組織切下外層（細胞活性好）癌塊，放于另一無菌平皿中。用剪刀將平皿中癌組織剪成12mm小塊，放入有磁力攪拌棒的小玻璃三角燒瓶中。第四十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月加入消化液（0.5%trypsin+0.04%EDTA）覆蓋組織塊。燒瓶放在磁力攪拌器上，緩慢攪拌15分鐘。重復步驟4，直到細胞組織塊完全消化，收集消化液于瓶中。吸出收集的消化液到另一個滅菌玻瓶中。離心3000rpm，15分鐘，棄上清。用含血清培養(yǎng)基懸浮沉淀。計數細胞。制備5105/ml細胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶（細胞懸液所占空間為培養(yǎng)瓶的1/3）。置37，CO2溫箱培養(yǎng)。接種細胞48小時后

27、，于倒置顯微鏡下觀察細胞，如細胞已大部分貼壁，可換液一次，清除上清中的死細胞，加入新的培養(yǎng)基。第四十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、結果接種細胞后319天（鱗癌、腺癌、小細胞癌），細胞開始生長。細胞為上皮樣（鱗腺癌）和圓形小細胞（小細胞癌）。細胞貼壁生長，增殖速度不同，分別從23112天傳第一代，細胞失去接觸性抑制，重疊生長。從低代開始凍存細胞，建立了 肺鱗癌細胞系，命名為LTEP-S（lung trmor epithelial pulmonary-squamous）；2個肺腺癌細胞系，為LTEP-al（adenocarcinoma-l）LTEP-a2；肺泡細胞癌細胞系， L

28、TEP-a3；小細胞肺癌，為LTEP-Sm(small cell line lung cancer)。第五十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）注意事項盡快培養(yǎng)腫瘤組織是獲得癌細胞建系重要的因素。及時去除生長的成纖維細胞（用刮除的方法較為簡便），有利于癌細胞的生長。掌握好第一次傳代時間，擴增均勻生長優(yōu)勢的癌細胞，使其在體外能夠成為細胞系。精心傳代、換液、避免污染，需經半年以上的細胞培養(yǎng)，方能夠達到建立細胞系的目的。第五十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 轉化細胞系建立轉化是指細胞發(fā)生了不可逆轉的遺傳改變而引起恒定表型改變的事件。轉化細胞系可由于細胞本身基因不穩(wěn)定

29、（嚙齒類）在傳代中自發(fā)發(fā)生，也可用放射、致突變劑、病毒以及外源基因等因素處理，引起細胞產生遺傳改變。 第五十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉化細胞系主要有3個類型改變： 有限分裂的細胞變?yōu)闊o限增殖的細胞，獲得不死性，成為永久性細胞系。細胞不正常自主性生長，喪失細胞接觸性抑制、過飽和密度、無停泊依賴等正常細胞生長特點。致瘤性。細胞可在免疫缺陷小鼠體內浸潤生長，形成腫瘤。 第五十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月判斷惡性轉化或一般轉化細胞系最主要的指標。惡性轉化細胞系已具有惡性表型。一般轉化細胞系也可能在體外有不正常的生長表型，但在體內不能形成腫瘤。第五十四張，PPT共

30、一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1誘變轉化細胞的方法（1）轉化細胞的選擇：可從原代培養(yǎng)的正常細胞、傳代的正常細胞選擇。成纖維細胞易于轉化，上皮細胞較難。第五十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）轉化因素：化學致突變劑，常用的甲基硝基亞硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine,MNNG）；物理方法：射線照射；病毒轉化：用EB病毒傳染淋巴細胞引起轉化，SV40病毒轉化正常細胞成為惡性細胞；用外源基因轉染細胞，誘發(fā)細胞轉化，已獲得較高的轉染率，轉化的外源基因包括癌基因如ras、mye，病毒基因，如SV40LT抗原基因、端粒酶基因等。第五十六張，PPT

31、共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2外源基因轉化細胞，建立轉化細胞系，包括以下程序： 選擇合適的外源基因，如SV40LT抗原基因傳染人成纖維細胞有效。構建外源基因表達載體（質粒），含有合適的標記基因作為陽性傳染細胞的選擇（質粒上有新霉素耐受基因，可用G418選擇）。第五十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇合適的轉基因方法：化學方法最常用磷酸鈣、脂質體（lipfectin）、基因槍、電轉移等。選擇合適的轉染細胞。用轉基因方法轉染細胞獲陽性集落。證明外源基因有無表達。證明轉染細胞的表型是否改變和有無致瘤性。第五十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）SV40LT抗原基

32、因轉化人的成纖維細胞： 雖然鼠來源的成纖維細胞可以經培養(yǎng)后成為長期培養(yǎng)的細胞系，但人的成纖維細胞在體外培養(yǎng)很難成為永久細胞系。用SV40LT抗原基因轉化人成纖維細胞是最成功的方法。第五十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料HEPES緩沖液，10CaHEPES，2CaHEPES磷酸緩沖液，NaAc,Tris-EDTA緩沖液，無水乙醇，Eagles MEM/15%FCS，G418。均為無菌液。第六十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法1）制備轉化所需DNA：制備DNA-磷酸鈣溶液：DNA20ug/ml，CaCl2 0.125M，NaPO4 0.75mM，NaCl 140m

33、M，HEPES 12.5Mm，pH 7012。2）轉化細胞的制備：對數生長的成纖維細胞，稀薄啊達7080%匯合，轉化前一天換液，用無血清培養(yǎng)基。3）轉化細胞：將1mlDNA磷酸鈣沉淀加入到培養(yǎng)皿（3ml）覆蓋細胞，處理6小時或更長，于37 CO2暖箱。第六十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4）去除和洗滌培養(yǎng)液，加入生長培養(yǎng)基（EMEM，15%FCS）培養(yǎng)48小時后，加入G418 200ug/ml。5）更換培養(yǎng)基，含G418濃度可降低或不變，鑒定耐受集落生長，直到大多數細胞死亡。6）可利用克隆環(huán)，挑選集落，用trypsin消化單個集落，繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞繼續(xù)生長。7）盡早凍存細胞，

34、傳代中多次凍存。8）持續(xù)傳代細胞，直到細胞死亡，不能再傳代。第六十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果可建立永久傳代的惡性轉化細胞系。但有可能用此方法建立的轉化細胞系不一定具有惡性特征，可能與所轉染細胞的基因穩(wěn)定有關。第六十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項】永久細胞系的建立，細胞具有過度生長的“危相”，大多數細胞死亡，僅少數集落出現。通過及時換液，保持培養(yǎng)液pH恒定和補充營養(yǎng)。第六十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）轉染端粒酶基因，可誘導轉化細胞系的建立： 端粒酶在細胞內表達，抵消細胞分裂所致端?？s短，是癌細胞獲得不死性的重要分子機制。轉

35、染外源端粒酶基因于有限期傳代的正常細胞系，包括人上皮細胞和成纖維細胞、血管內皮細胞等，均可誘導產生永久性細胞系，并證明了轉染細胞中，端粒酶表達和端?？s短受到了控制。第六十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月最近有報告證明了用猿SV40病毒基因和人端粒逆轉錄酶基因（HTERT gene）兩種轉化方法轉染人的上皮細胞，均可獲得不死性細胞系，在轉化細胞內可檢測到端粒酶活性和控制了端?？s短。第六十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月SV40誘導的不死性細胞，伴有細胞不正常分化和核型不穩(wěn)定，表現出對動物一定程度的致瘤性。而端粒酶傳染的細胞很少有核型的改變和上皮細胞分化的特點，保持更多

36、正常細胞的表型。說明用SV40LT抗原基因和HTERT gene 轉化細胞存在一定差異，SV40LT多引起細胞惡性轉化，而HTERT gene 主要誘導細胞獲得不死性。第六十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）轉基因小鼠： 利用轉基因小鼠可以建立轉化細胞系，基本方法是設計有某種基因突變、缺失、嵌入病毒基因的DNA，植入小鼠的卵母細胞。發(fā)育的轉基因小鼠將攜帶有表達某種基因的組織，從小鼠組織取材，可以獲得轉化細胞系。例如H2kbtsA58轉基因小鼠，含有SV40LT抗原，從小鼠各種組織取材，可以建立多種永久轉化細胞系。因此，利用轉基因小鼠是建立細胞系快速有效的方法。第六十八張，PP

37、T共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）EB病毒感染B細胞建立轉化細胞系EB病毒感染人外周血B淋巴細胞后，B細胞便能夠被轉化，并在體外繼代生長，建立細胞系，長期儲存的液氮，解決研究中大量細胞的來源。第六十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料和方法：取健康人外周血5ml，加肝素（10u/ml）抗凝常規(guī)免疫方法分離淋巴細胞，用RPMI-1640含10%新生牛血清培養(yǎng)液，洗滌一次 1000rpm 10min離心，沉淀細胞懸浮于RPMI-1640 20%胎牛血清 調整細胞濃度。第七十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月EB病毒 標準株 B95-8 細胞系可產生高濃度EB病毒上清

38、（5105/ml），用0.22um微孔濾膜過濾獲細胞培養(yǎng)上清分裝儲存?zhèn)溆?。第七十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月淋巴細胞特征：取淋巴細胞懸液1ml，EB病毒1ml加至培養(yǎng)瓶混勻，371h，吸附后，加入34ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，375%CO2孵育35天后用倒鏡觀察淋巴細胞程度，補加培養(yǎng)液 當細胞濃度達1106/ml，離心收集懸浮細胞，凍存液氮，同時采用合成黃染檢測細胞活性，以細胞存率來評估細胞凍存前后的活性，一般凍存前的細胞活性約95%，凍存后為90%。第七十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月在轉化過程中，淋巴細胞的濃度（2105/ml）和EB

39、病毒的滴度、用量、新鮮程度-70儲存9個月內EB病毒1ml均對淋巴細胞的轉化為適合，轉化成功率達85100%。但在EB病毒轉化B細胞的同時，又能刺激T細胞亞群的活性，細胞毒T細胞作用B細胞使轉化失敗，克服這一作用可通過控制淋巴細胞接種密度和加入環(huán)胞素A來消除毒性T細胞作用。（參考鄭從義等報導）第七十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、癌細胞系和轉化細胞系注意事項第七十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月針對癌細胞建系存在的問題，進行細胞培養(yǎng)技術的改進，包括：采用無血清或低血清培養(yǎng)基，可以抑制成纖維細胞的生長和降低其對癌胞生長不利的影響。同時補充癌細胞生長必要的成分。如上

40、皮生長因子、轉鐵蛋白、胰島素等。事實上僅少數建立的癌細胞系使采用無血清培養(yǎng)基。這可能與無血清培養(yǎng)需加入的其他成分價格昂貴和制備不便有關。第七十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月接種癌細胞成纖維細胞飼養(yǎng)層，有利癌細胞的生長。除去生長的成纖維細胞。由于組織培養(yǎng)技術的改進，國外癌細胞建系率已很高。國內癌細胞的建系還較少，就組織培養(yǎng)方法仍待改進。第七十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月建立轉化細胞系，通常用已建成的正常細胞系進行轉化，所以不存在上述癌細胞建系原代培養(yǎng)所存在的問題。能否建成轉化細胞，除要選擇合適的細胞系外（遺傳形狀過于穩(wěn)定的細胞不易轉化）對轉化方法的選擇也很關鍵。

41、轉染外源病毒基因，如SV40LT，有較高的轉化率。該方法在國內已能很好應用。從轉基因小鼠組織取材建立細胞系在國外已有一些報告，該方法的應用，不僅提高了建系率，而且使那些常規(guī)細胞培養(yǎng)方法不能建立的細胞系，通過轉基因動物可以建立攜帶某種靶基因的細胞系，為細胞培養(yǎng)和建立細胞系開拓了新的局面。第七十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、癌細胞系和轉化細胞系的鑒定癌細胞有染色體DNA、RNA已經蛋白質水平的分子異常和惡性表型，癌細胞系應反映來源癌組織的分子異常和惡性表型。因此，癌細胞系的鑒定主要包括細胞組織來源和惡性特征。隨著細胞分子生物學的進步，對癌細胞認識的深入，反映在鑒定癌細胞系惡性特

42、征的指標也越來越多。轉化細胞如果是正常細胞系轉化而來，不需再進行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，已經確定是惡性轉化或一般轉化。第七十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、癌細胞系和轉化細胞系的鑒定癌細胞有染色體DNA、RNA已經蛋白質水平的分子異常和惡性表型，癌細胞系應反映來源癌組織的分子異常和惡性表型。因此，癌細胞系的鑒定主要包括細胞組織來源和惡性特征。隨著細胞分子生物學的進步，對癌細胞認識的深入，反映在鑒定癌細胞系惡性特征的指標也越來越多。轉化細胞如果是正常細胞系轉化而來，不需再進行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，已經確定是惡性轉化或一般轉化。第七十九張，PPT

43、共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）細胞形態(tài)學1光鏡直接檢查結果癌細胞呈多邊形上皮樣細胞，易于和正常成纖維細胞區(qū)分。癌細胞正失支正常細胞間接觸性抑制，呈現重疊生長?？梢娂毎丿B層上有折光度強的圓形細胞。這些特點可與正常上皮細胞區(qū)分，轉化細胞可出現與癌細胞重疊生長相似的特點。第八十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細胞染色檢查見正常細胞鑒定，除Giemsa染色外，可用瑞氏結晶紫等染色結果癌細胞呈多邊形，排列不規(guī)則，細胞重疊。細胞核大，核漿比例增大，深染突出、不規(guī)則，可見異常分裂象。有的上皮樣轉化細胞有相同特點。第八十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、細胞超微結構

44、的檢查結果細胞核大，不規(guī)則。胞漿內如觀察到橋粒、張力原纖維等可上皮細胞的特點，觀察到分泌顆粒是腺細胞特點，如有神經分流顆粒是神經內分泌細胞特點。細胞超微結構檢查對于鑒定細胞系的組織來源和細胞惡性特點有重要意義。第八十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）染色體異常癌細胞存在多種染色體水平的異常。癌細胞是異倍體，存在染色體缺失、重排和移位等異常，染色體顯帶技術可用于檢查和鑒別正常細胞和惡性細胞染色體差異。檢查染色體異常除用普通方法外，還可用染色體分帶技術來檢查染色體細微改變。染色體分帶技術是用特殊技術將染色單體上著色出深淺帶（band），顯示染色體的結構。第八十三張，PPT共一百二

45、十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、trypsin-G 帶染色材料：細胞中期染色體標本（見正常細胞染色體分析部分），trysin-Giemsa混合染液，水浴箱。方法（1）預處理：癌細胞系中期染色體標本置6080水浴30分鐘左右或37過夜，取出玻片放入0.025M磷酸緩沖液（pH6.8）5610分鐘（2）用新配置的trypsin-Giemsa混合顯帶液處理10-30分鐘（3）封片：染色后用自來水沖洗（沖洗標本背后，以色沖洗過分，使細胞脫落），封片第八十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果可見到清晰的每條染色體和上面的分帶。癌細胞核型異常為異倍體，多在亞二倍體和三倍體之間，與正常細胞二倍體

46、不同，每條染色體數目有增多或減少。在每條染色體上帶型與正常標準相比，有缺失和增加的帶以及移位等異常表現。通常轉化為異倍體。第八十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、Giemsa顯帶法材料細胞中期染色體標本，trypsin消化液，Giemsa染液，水浴箱。方法（1）預處理：標本置入6080溫箱20-30分，37烤箱過夜。（2）trypsin消化：3-5分鐘，沖洗多余的酶（3）將標本放入Giemsa染液中染色10分鐘（4）封片：自來水沖洗，晾干后二甲苯透明2-3分鐘，封入樹膠第八十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果可見到清晰的每條染色體和染色體上的分帶。癌細胞核型為異

47、倍體，多在來二倍體和三部體之間，與正常細胞二倍體不同，每條染色體數目有增多或減少。在每條染色體上的帶型與正常標準相比，可以顯示染色體帶區(qū)細微結構改變，如移位、倒置、缺換等異常這些異常是細胞系的遺傳標記。如幾乎在100%的小細胞肺癌和腎癌有三號染色體短臂缺失發(fā)生，為鑒定細胞系的組織來源提供了依據。從染色體核型分析可以辨別是人或鼠來源（見正常細胞系鑒定）。第八十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）體外生長異常癌細胞（或轉化細胞）體內外無控制增殖是惡性細胞的特征。癌細胞喪失正常細胞接觸性抑制、停泊依賴等生長特點，表現為增殖加速，生長呈過程和密度，在軟瓊脂上形成集落等不正常生長特點，通

48、過以下實驗，對于鑒定惡性生長有重要意義。第八十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、生長曲線和倍增時間培養(yǎng)細胞經歷一代（從上一代傳代到下一次傳代的時間，通常7天左右），包括潛伏期、對數期、平坦期三個階段。通過計數7天細胞，可以記錄出生長階段，繪制出生長曲線，計算出細胞倍增時間。可鑒定癌細胞和正常細胞群體生長增殖速度的差異。第八十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料0.25% trypsin +0.04%EDTA消化液，含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，0.1%臺酚藍溶液，平皿，培養(yǎng)皿，血球計數器，半對數紙。第九十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1

49、）對數期生長的細胞于試驗前一天換液。如檢測轉化細胞，可同時接種轉化前細胞，以便比較。（2）用trypsin消化細胞制備細胞懸液，用生長培養(yǎng)基制備3X104/ml細胞懸液，每種細胞接種于25個直徑35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿3ml，于CO2暖箱37培養(yǎng)。第九十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（3）次日于顯微鏡下挑選細胞生長均勻的培養(yǎng)皿，共21皿。（4）每日取3個平皿trypsin消化，將細胞懸液用血球計數器計數活細胞（0.1%臺酚藍溶液0.9ml加入0.ml細胞懸液），計算活細胞平均數，連續(xù)7天。（5）以細胞數為縱坐標，培養(yǎng)天數為橫坐標，在半對數紙上繪制生長曲線，并計算細胞倍增時

50、間。第九十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果癌細胞潛伏期短，對數期生長明顯，轉化細胞與轉化前細胞相比較，可見轉化細胞對數期生長速度明顯增加。依據生長曲線，計算出細胞倍增時間。倍增時間短，反映了細胞惡性生長。第九十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項為了制備準確的細胞生長曲線，接種的細胞數要合適，對于癌細胞和轉化細胞，通常接種3X104/ml細胞。但在不同細胞系生長速度差異較大，可以根據情況調整。為了防止每皿細胞的實驗誤差，可以在開始時多接種幾皿細胞，以便挑選細胞生長更均一的平皿進行實驗，每日計數至少3皿，減少皿間差異。第九十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于20

51、22年6月2、克隆效應（cloning efficiency）克隆效應也可稱為集落形成率（rate ov colohy formation），是檢測群體細胞中增殖細胞的比率，可反應細胞系的增殖能力，因此是鑒別腫瘤細胞（或轉化細胞）與正常細胞的增殖能力的指標。材料培養(yǎng)皿，生長培養(yǎng)基，甲醇，Gimsa染液，血球計數器。第九十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1）對數生長的癌細胞或轉化細胞及其母系細胞，每種細胞接種3個平皿，于實驗前一天換液。實驗當天，顯微鏡下觀察細胞生長情況良好，用trypsin充分消化，必須制備成單個細胞懸液。計數細胞，將細胞懸液濃度稀釋到每毫升250或150個

52、細胞，每個平皿接種2ml細胞懸液（每皿300或500個細胞）第九十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24周。（3）取平皿，用PBS沖洗自然干燥，用甲醇固定10分鐘，Giemsa染色。立體顯微鏡下計數集落，每個集落需達50個細胞。（4）計算集落形成率：集落形成率=平均集落數/每皿接種的細胞數。 第九十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果腫瘤細胞和轉化細胞具有較高的集落形成率，通常可達10%以上，正常細胞有較低的集落形成率，僅1%左右。第九十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項該實驗是檢測在群體細胞中增殖細胞的比率，試驗需接種低密度

53、細胞，3cmX3cm平皿接種300500個細胞，消化細胞要充分，以保證制備單個細胞懸液和接種單個細胞形成的集落。由50個以上細胞組成的細胞集落計數，低于50個細胞不能計數。第九十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、放射自顯影測定細胞飽和密度核素放射自顯影是用核素電離輻射對核子乳膠感光作用顯示核素的分布、定位和定量的方法。嘌呤和嘧啶堿基是細胞DNA合成的前體，標記有放射性核素的堿基加入培養(yǎng)細胞液中，可以滲入到細胞DNA合成，細胞經過洗滌，固定涂乳膠，干燥后，于暗室中曝光，經顯影后，細胞可在光鏡下檢測銀顆粒，計算出標記細胞的百分數。由于癌細胞或轉化細胞失去接觸性抑制，無限制性生長，因

54、此標記指數高。第一百張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料DMEM培養(yǎng)基+10%滅活胎牛血清，用DMEM培養(yǎng)基配制，3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine），使?jié)舛葹?u Gi/ml，PBS ，0.25%TRYPSIN+0.04%EDTA，含蓋玻片的培養(yǎng)皿，血球計數器，固定細胞，冷醋酸甲醇（acetic:methanol為1：3,ice-cold）新鮮制備，去離子水，放射自顯影，乳膠，曝光盒。第一百零一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1）培養(yǎng)細胞和核素標記：對數期生長的癌細胞（或轉化細胞）于試驗前一天換液，0.25%trypsin+0.04%EDTA 充分消化細胞

55、，用含血清DMEM制備每毫升105個細胞懸液，接種到多個含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，于CO2暖箱37培養(yǎng)。2-3天后，每日換液。當蓋玻片細胞已成片匯合，每日取出玻片，用消化液消化細胞，制備細胞懸液，計數細胞。當蓋玻片上計數細胞，已達到平坦期，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞表面，去除血清。加入2ml含1uci/ml的胸腺嘧啶DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時于CO2暖箱37。第一百零二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）固定細胞：用PBS輕輕沖洗玻片以去除未標記的核素，將蓋玻片旋轉在載玻片上，細胞面朝上，細胞用冷醋酸甲醇固定10分鐘。（3）放射自顯影：涂片乳膠：暗室紅燈下46水浴中，熔化乳

56、膠，將培養(yǎng)細胞的小玻片用膠布固定在載玻片上，浸泡乳膠，保持在465秒鐘，俁乳膠均勻涂細胞上，取出的玻片放在切片架上，使乳膠習題成薄片，使其慢慢干燥（2-3小時）。把干燥片放入嚴密的曝光盒內，于4冰箱曝光。曝光時間長短取決于多種因素，一般3-7天不定。第一百零三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月顯影和定影：顯影時間取決于核素的劑量，一般20左右，顯影35分鐘，經過1%醋酸溶液1-3分鐘，置于定影液中30-60分鐘。染色和封片：用水洗2分鐘，用去離子水洗1次，用Giemsa染色，將蓋玻片黑覆蓋在玻片上封片。鏡檢：高倍光鏡下可見細胞核銀染顆粒，為標記陽性。第一百零四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結果計數標記的細胞數（核或細胞有銀染顆粒 ）占總細胞數的百分率，為標記指數。癌細胞或轉化細胞標記指數高于正常細胞，顯示過飽和生長，轉化細胞與母系相比有明顯差異。第一百零五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項 應將檢測的細胞培養(yǎng)到平坦期時加入核素標記細胞，以顯示癌細胞或轉化細胞失去正常細胞接觸抑制或呈過飽和密度生長。為了很好計數細胞中的銀染顆粒，應保證細胞中的銀染顆粒呈較高密度。應在實驗操作中避免殘留核素造成的細胞背底過高，影響計數結果。第一百零六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4、軟瓊脂集落試驗腫瘤細胞或轉化