熒光分析和化學(xué)發(fā)光分析

1、關(guān)于熒光分析與化學(xué)發(fā)光分析第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 6-1 概 述 在前兩章中我們討論了物質(zhì)對電磁輻射的吸收。吸收輻射能后，處于電子激發(fā)態(tài)的分子在返回基態(tài)時(shí)以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，發(fā)射的輻射波長可以同分子所吸收的輻射波長相同，也可不相同，這一現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。最常見的兩種光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。這兩種光致發(fā)光過程的機(jī)理不同(見6-2)，可通過實(shí)驗(yàn)觀察激發(fā)分子壽命的長短來加以區(qū)別。對于熒光，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程幾乎立即停止(10-9 10-6)，而磷光則將持續(xù)一段時(shí)間(10-3 10s)。第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 一般所謂熒光現(xiàn)象是

2、指物質(zhì)吸收紫外光后所發(fā)射出的可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后所發(fā)射出的波長較長的可見光熒光。但實(shí)際上熒光現(xiàn)象并不限于這些情況。有些物質(zhì)吸收了比紫外光波長短得多的光后，發(fā)射出波長比所吸收的光波長稍長的光，這稱為光熒光，并據(jù)此建立了光熒光分析法(有關(guān)此法的詳細(xì)討論見第十四章)。此外，有些物質(zhì)吸收了紅外光后發(fā)射出波長稍長的紅外光，這稱為紅外光熒光。近年來，隨著紅外探測器靈敏度的不斷提高，紅外光熒光分析法已應(yīng)用于許多有機(jī)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 由于物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長和發(fā)射的熒光波長也有所不同，利用這個(gè)特征可以對物質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。同一種分子

3、結(jié)構(gòu)相同的物質(zhì)，用同一種波長的紫外光照射激發(fā)，可發(fā)射特征波長的熒光，其強(qiáng)度與物質(zhì)的量有關(guān)。據(jù)此，可利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)射的能反映出該物質(zhì)特性的熒光進(jìn)行定性以及定量分析，這種分析稱為熒光分析。第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)發(fā)光分析是利用化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象進(jìn)行分析測定的一類方法。與熒光分析一樣，屬于發(fā)光分析的范疇。化學(xué)發(fā)光與熒光分子的發(fā)光相似，他的大部分性質(zhì)和熒光相同，不同點(diǎn)在于熒光的激發(fā)能來自外光源的激發(fā)(照射)，而化學(xué)發(fā)光的激發(fā)能則產(chǎn)生自化學(xué)反應(yīng)，也即某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，使分子或原子被激發(fā)，這種受激分子或原子返回基態(tài)時(shí)，以光輻射的方

4、式釋放能量。其光輻射的能量及光譜范圍由化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)所控制(處于可見光區(qū))。每一個(gè)化學(xué)反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)射光譜，其發(fā)光強(qiáng)度則與物質(zhì)的濃度有關(guān)，這是化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)。第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 此外還有其他類型的發(fā)光: 生物發(fā)光、熱致發(fā)光、放射發(fā)光(放射性分解引起激發(fā))、聲致發(fā)光(聲波激發(fā))、點(diǎn)發(fā)光(電激發(fā))、摩擦發(fā)光(機(jī)械能激發(fā))等。其中生物發(fā)光在分析化學(xué)中得到重要的應(yīng)用，在生物發(fā)光中導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的化學(xué)反應(yīng)是在生物體內(nèi)進(jìn)行的。 磷光現(xiàn)象也被用于分析目的，但應(yīng)用范圍有限。第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月6-2 熒光分析法基本原理熒光定性分析 熒光定量分析熒光

5、計(jì)與熒光分光光度計(jì)第七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 熒光的發(fā)生 處于基態(tài)的分子吸收一定波長的輻射能后。電子發(fā)生躍遷。此時(shí)由 原來的能級躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng) 能級和各個(gè)不同的轉(zhuǎn)動(dòng)能級，如圖6-1中(a)和(b)所示。分子在吸收了 光而被激發(fā)至第一或更高的電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級之后，通常急 劇降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低 振動(dòng)能級，在這一過程中他們和 同類分子或其他分子(例如溶劑分 子)碰撞而消耗了相當(dāng)于這些能級 之間的能量，因而不發(fā)射光(無輻 射躍遷，圖6-1中c)。由第一電子 激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級繼續(xù)往下 降落至基態(tài)的各個(gè)不同能級時(shí)， 則以光的

6、形式發(fā)射，所發(fā)生的光 即熒光(圖6-1中d)。某些物質(zhì)的分子在被激發(fā)至較高的能級并通過無 輻射躍遷降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級之后，并不繼續(xù)直接 降落至基態(tài)，而是通過另一次無輻射躍遷至一個(gè)中間的亞穩(wěn)的能級 三重態(tài)(圖6-1中e)。一、基本原理第八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 已知電子激發(fā)態(tài)的自旋多重性為2S+1，S是自旋量子數(shù)的代數(shù)和。大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，在基態(tài)時(shí)這些電子成對地存在于各個(gè)原子或分子軌道中。然而，根據(jù)保利不相容原理，在一個(gè)軌道上的這兩個(gè)電子的自旋是相反的，自旋量子數(shù)為+()和-()。由于自旋成對的結(jié)果，大多數(shù)分子的自旋量子數(shù)的代數(shù)和S=0，此時(shí)這個(gè)分子所處

7、的電子能態(tài)稱為單重態(tài)(singlet state)，即2S+1=1。如果分子中有一個(gè)未成對的電子，則S=，而2S+1=2，此種狀態(tài)稱為雙重態(tài)(doublet state)。若分子中有兩個(gè)未成對的電子，此時(shí)S=1,2S+1=3，這種狀態(tài)稱為三重態(tài)(triplet state)。第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在基態(tài)分子的一個(gè)電子吸收光輻射而被激發(fā)的過程中，通常它的自選不變(S=0)，則激發(fā)態(tài)仍是單重態(tài)，如圖6-2所示。某些分子的激發(fā)單重態(tài)通過無輻射躍遷，在體系間跨越的過程中發(fā)生自選反轉(zhuǎn)，造成兩個(gè)電子自旋平行的狀態(tài)，也即是激發(fā)三重態(tài)(6-2)。第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于202

8、2年6月 這些分子在三重態(tài)稍事逗留后，在發(fā)射輻射而下降至單重態(tài)各振動(dòng)能級，所發(fā)射的光即為磷光(圖6-1中f)。因自三重態(tài)降落至單重態(tài)時(shí)所給出的能量比由單重第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級直接降落至單重基態(tài)時(shí)所給出的能量小，所以磷光的波長比熒光波長長。如將溫度降低，則由三重態(tài)降落至單重態(tài)的時(shí)間將大為延遲，在很低的溫度下，這些分子有可能被“凍結(jié)”在三重態(tài)上。某些分子在躍遷至三重態(tài)后，通過熱激活作用可 以再回到第一電子激發(fā)態(tài)的 各個(gè)振動(dòng)能級，然后再由第 一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能 級降落至基態(tài)而發(fā)射出熒光， 這種熒光就被稱為遲滯熒光 (圖6-1中g(shù)和f)。第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月

9、如果把蒽的乙醇溶液裝入試管，并放在液氮中，并用紫外光照射，停止照射后，還能見到蒽溶液輻射出的橙色光，而光的強(qiáng)度隨時(shí)間的延長而逐漸變?nèi)酰罱K消失為止。這種即使停止用光激勵(lì)，還能繼續(xù)發(fā)光的現(xiàn)象，就是蒽的磷光。圖6-3表明了蒽吸收了波長366nm的光，生成最低激發(fā)單重態(tài)S1， S1輻射熒光到基態(tài)，同時(shí)激發(fā)單重態(tài)S1體系間跨越到三重態(tài)T1，T1輻射磷光回到基態(tài)。第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜 熒光發(fā)射光譜簡稱熒光光譜，它表示該熒光物質(zhì)所發(fā)射的熒光中各種不同波長組分的相對強(qiáng)度，是以熒光強(qiáng)度對熒光波長所繪制的曲線。 如果把某物質(zhì)的熒光光譜與他的吸收光譜進(jìn)

10、行比較，可發(fā)現(xiàn)這兩種光譜之間存在著密切的“鏡像對稱”關(guān)系。熒光光譜好像是吸收光譜照在鏡子中的像，但又比吸收光譜缺少了一些短波 長的吸收峰。圖6-4表示蒽的乙醇 溶液的熒光光譜和吸收光譜。第十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 化合物的熒光和化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系 產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件。首先，物質(zhì)分子必須具有能吸收紫外或可見光的生色基團(tuán)；其次該物質(zhì)應(yīng)具有一定的熒光效率。分子中能發(fā)射熒光的基團(tuán)，稱為熒光基團(tuán)。熒光基團(tuán)一定是生色基團(tuán)，但生色基團(tuán)未必一定是熒光基團(tuán)。這是由于它的熒光效率不高，而將所吸收的能量消耗于與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子之間的相互碰撞，因此不能發(fā)射熒光。 熒光效率(F)又稱

11、為熒光量子產(chǎn)率，是熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光量子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的量子數(shù)的比值，即 F= 此外，一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境緊密相關(guān)，因?yàn)榄h(huán)境條件(如溶劑、pH、溫度等)常常是物質(zhì)量子產(chǎn)率高低，甚至能否產(chǎn)生熒光的重要因素。發(fā)射的量子數(shù)吸收的量子數(shù)第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 熒光通常發(fā)生于具有剛性平面結(jié)構(gòu)的電子共軛體系的分子中，隨著電子共軛度和分子平面度的增大，熒光效率也將增大，它們的熒光光譜也將移向長波方向。任何有利于提高電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，使熒光波長向長波長的方向移動(dòng)。 絕大部分的熒光(磷光)物質(zhì)都是環(huán)狀化合物(芳香環(huán)或雜環(huán))，

12、芳香環(huán)越多，熒光效率越高，熒光光譜也移向長波長方向(表6-1)。但環(huán)狀結(jié)構(gòu)并不是發(fā)生熒光的絕對條件，如吡啶( )、呋喃( )、噻吩( )和吡咯( )是非熒光或弱熒光物質(zhì)。但取代上苯基后，由于共軛體系的增大，熒光效率將大為增加。 例如苯并呋喃( )、吲哚硫茚的熒光和笨相近。第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在芳香化合物的芳環(huán)上進(jìn)行不同基團(tuán)的取代，對該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜都將產(chǎn)生影響。通常有以下一些規(guī)律： (1) 給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)，因?yàn)樗鼈兪棺畹图ぐl(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。作用特別明顯的基團(tuán)是-NH2和-OH。 (2) 同電子體系相互作用小的取代基如 -SO3H

13、、 -NH3 和烷基等，對熒光影響小。 (3) 吸電子基團(tuán)如-COOH、-NO2、-N=N-及鹵素會(huì)減弱甚至破壞熒光。 (4) 重原子或雜原子引入到電子體系中常會(huì)減弱熒光，所以苯胺和苯酚的熒光較苯強(qiáng)20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯則是非熒光或弱熒光物質(zhì)。表6-2表明取代基對苯的熒光的影響。+第十六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子有利于熒光的產(chǎn)生。這可以比較熒光素和酚酞的結(jié)構(gòu)來說明: 又如芴和聯(lián)苯在類似的測量條件下的熒光效率分別為1.0和0.2。這是由于芴上的亞甲基增強(qiáng)了分子的剛性的緣故。 有些有機(jī)分子本身不會(huì)發(fā)熒光，但與金屬形成絡(luò)合物后，由于增強(qiáng)了他的剛性并大

14、大減少了分子的內(nèi)振動(dòng)作用，因而產(chǎn)生熒光。第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 前文已述，由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外波長和發(fā)射的熒光波長具有特征性，因此根據(jù)熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可鑒別化合物。最直接的熒光定性分析方法是將待分析的熒光發(fā)射光譜與預(yù)期化合物的熒光發(fā)射光譜相比較。這種方法比較簡便并常能取得較好的效果。圖6-5(a)(b)是從一個(gè)城市河流底泥試樣中以熒光法鑒定苯并()芘的實(shí)例。二、熒光定性分析 圖6-5 苯并()芘和苯并()芘的熒光激發(fā)光譜及發(fā)射光譜第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 對于一些復(fù)雜的樣品來說，光譜鑒定有時(shí)會(huì)發(fā)生困難?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)加入

15、的辦法。即在試樣中添加擬存在的組分，若此組分存在，則在添加該組分的純物質(zhì)加入后，該物質(zhì)的特征峰將加強(qiáng)。 同步掃描熒光法可使光譜簡化和窄化，是原來互相重疊的光譜分辨開來，從而提高了熒光法的選擇。同步掃描法通常在固定時(shí)進(jìn)行，此時(shí)使激發(fā)單色器和發(fā)射單色器的波長差(= Em- En)保持固定地同時(shí)進(jìn)行掃描，所得譜圖稱為同步光譜，所測得的熒光信號為同步信號。第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 圖6-7 菲、蒽、苝的光譜圖圖6-8 萘、菲、蒽、苝、并四苯混合物的常規(guī)熒光光譜及混合物的同步光譜圖圖6-9 工廠區(qū)大氣樣品萃取物中強(qiáng)致癌物苯并()芘及其共存物的熒光光譜和同步光譜第二十張，PPT共二

16、十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系 熒光的發(fā)光是由于物質(zhì)在吸光之后發(fā)射出波長較長的熒光，因此溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液的吸光程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。溶液被入射光(I0)激發(fā)后，可以在溶液的各個(gè)方向觀察到熒光強(qiáng)度(F)。但由于激發(fā)光源能量的一部分被透過，因此，在透射光的方向觀察熒光是不適宜的。一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀測。 根據(jù)比耳定律，透過光的比例為 式中： I0為入射光(激發(fā)光)強(qiáng)度； I為透過光強(qiáng)度；C為濃度，b為液層厚度；為摩爾吸光系數(shù)。 相應(yīng)地被吸收的部分是 將上式重新排列，可得被吸收的光的量為 I0-I= I0 (1-10 ) (6-3) 三、 熒

17、光定量分析II0- =10-b C-b C 1- - =1-10I0I-b C(6-2)(6-1)第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 總的熒光強(qiáng)度(F) 同試樣吸收的激發(fā)光的光量子數(shù)目和熒光量子效率(F)成正比 F = F(I0-I)= I0 F(1-10 ) (6-4) 將上式括弧中指數(shù)項(xiàng)展開可得 F = I0 F (6-5) 對于很稀的溶液，投射到試樣溶液上被吸收的激發(fā)光不到2 時(shí)，也就是b C =A0.05時(shí)，括弧內(nèi)第二項(xiàng)以后可以忽略不計(jì)，則上式可簡化為 F = 2.3 F b C I0 (6-6) 對于一定的熒光物質(zhì)，當(dāng)分析條件及儀器使用條件確定后，上式中F 、 、b

18、、I0 均為常數(shù)，當(dāng)被測熒光物質(zhì)的濃度C很小時(shí)(b C 0.05)，式(6-6)可寫作 F = kC (6-7) 即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。但當(dāng)b C 增大時(shí)，從式(6-5)可以看出濃度與熒光強(qiáng)度之間呈非線性關(guān)系，若b C 很大時(shí)，式(6-5)成為 F = I0 F (6-8) 此時(shí)熒光強(qiáng)度與濃度無關(guān)。因此在熒光分析中，熒光強(qiáng)度和濃度的線性關(guān)系僅限于很稀的試液。-b C2.3 b C- - (- 2.3 b C )2!(- 2.3 b C )3!23第二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 影響熒光強(qiáng)度的因素 (1) 激發(fā)光照射的影響 對于容易分解的熒光物質(zhì)的測定，

19、應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定能準(zhǔn)確讀取熒光強(qiáng)度的方法。 (2) 溫度影響 通常熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低而熒光強(qiáng)度增大。一般溫度升高1，熒光強(qiáng)度約下降1。 (3) 溶劑影響 一般來說，熒光強(qiáng)度隨著溶劑極性的增大而增強(qiáng)。 (4) 溶液pH的影響 當(dāng)熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時(shí)，溶液pH值的改變對熒光強(qiáng)度將有很大的影響。對于金屬離子與有機(jī)試劑形成的絡(luò)合物，溶液pH值的改變還會(huì)影響到絡(luò)合物的組成，從而影響到它們的熒光性質(zhì)。 (5) 各種發(fā)散光的影響 主要是散射光和拉曼光。降低方法:從儀器上考慮；從溶劑考慮。 (6) 熒光熄滅 熒光物質(zhì)和溶劑或其它溶質(zhì)分子的互相碰撞或電子轉(zhuǎn)移等作用引起的。鹵素離子、重金屬離子、氧分子以

20、及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等都是顯著地?zé)晒庀鐒?(7)熒光自滅 熒光物質(zhì)的濃度大于1gL時(shí)，常發(fā)生熒光的自滅現(xiàn)象。 由上述可見，最適宜的測定條件如pH、溶劑、試劑的濃度、溫度以及熒光強(qiáng)度最大時(shí)所需的時(shí)間等都需要試驗(yàn)來確定。 第二十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 定量分析方法 (1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 熒光分析一般多采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(工作曲線)法，尤其在測定大批樣品的例行測定時(shí)更是如此。 (2) 直接比較法 取已知量的純熒光物質(zhì)配制一標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在線性范圍內(nèi)，測定熒光強(qiáng)度(Fs)。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度(Fx)。由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(Cs)和兩個(gè)溶液的熒

21、光強(qiáng)度，求試樣中熒光物質(zhì)的含量(Cx)。在空白溶液的熒光強(qiáng)度若未能使儀器讀數(shù)調(diào)至0，則必須從Fs及Fx值中扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度(F0)，然后進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)式(6-6)可得 Fs - F0 = 2.3 F b I0 Cs Fx - F0 = 2.3 F b I0 Cx 因?yàn)閷τ谕粺晒馕镔|(zhì)， F及 相同，且b 一定，故 (3) 熒光熄滅法 利用熒光熄滅現(xiàn)象可對某些物質(zhì)進(jìn)行定量測定。 (4) 同步掃描熒光法 同步熒光信號的強(qiáng)度與欲測熒光物質(zhì)的濃度(濃度很稀時(shí))呈線性關(guān)系。但是，同步熒光法存在濃度效應(yīng)。欲克服，只需將溶液適當(dāng)稀釋即可。F = 2.3 F b C I0 (6-6)Fs - F0 CsFx - F0 Cx = Cx = Cs (6-9)Fx - F0Fs - F0第二十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 測定熒光強(qiáng)度的儀器有目測熒光計(jì)、光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)等。它們主要由光源、濾光片、或單色器、樣品池及檢測器等部件組成。常用的熒光計(jì)是由濾光片、硒光電池及微電流計(jì)裝配成的光電熒光計(jì)，如圖6-12。 在測定微量熒光物質(zhì)含量時(shí)，使用濾光片光電熒光計(jì)可得到滿意的結(jié)果。但如前所述，各種不同的熒光物質(zhì)具有不同的熒光光譜和熒光激發(fā)光譜，為了研究某種熒