HPLC(液相色譜)常識(shí)及疑難詳解(附實(shí)際操作圖解)

1、1液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)1.1液相色譜名詞術(shù)語Mobilephase:流動(dòng)相，在色譜柱中存在著相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相，一相為固定相，一相為流動(dòng)相。流動(dòng)相是指在色譜過程中載帶樣品（組分）向前移動(dòng)的那一相。Stationaryphase:固定相，柱色譜或平板色譜中既起分離作用又不移動(dòng)的那一相。Gradientelution:梯度洗脫,一個(gè)分析周期中，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比,使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。Detectionwavelength:檢測(cè)波長(zhǎng)，retentiontime:保留時(shí)間，被分離樣品組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時(shí)的時(shí)間Pe

2、ak:峰PeakBase：峰基線，經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸PeakHeight:峰高，色譜峰頂點(diǎn)至峰底的距離。PeakWidth:峰寬，色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)間的距離PeakWidthatHalfHeight:半峰高寬PeakArea:峰面積TailingPeak:后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰LeadingPeak:前沿較后沿平緩的不對(duì)稱峰GhostPeak:假峰，并非由試樣所產(chǎn)生的峰BaselineDrift:基線漂移BaselineNoise:基線噪音BandBroadening:組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過程中譜帶寬度增加的

3、現(xiàn)象.1.2流動(dòng)相流動(dòng)相類型正相液相色譜流動(dòng)相：一般正相色譜固定相極性大于流動(dòng)相極性，采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等），極性小的組分先出柱。反相液相色譜流動(dòng)相：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物，極性大的組分先出柱（現(xiàn)在大部分液相用的是反相色譜法）。流動(dòng)相注

4、意事項(xiàng)1221pH值的選擇C18和C8使用的流動(dòng)相pH值通常為2.57.5（28）,太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。濾膜的使用對(duì)于鹽類等試劑，或者沒有色譜純的試劑，可以使用分析純的，但是在使用前需要用0.45um或0.22um的濾膜過濾。鹽類試劑最好現(xiàn)配現(xiàn)用。使用濾膜時(shí)應(yīng)注意：有機(jī)膜能濾水系，水系膜不能濾有機(jī)。如果流動(dòng)相是有機(jī)溶劑的比例，那么就應(yīng)該用有機(jī)膜過濾(但是如果是梯度進(jìn)流動(dòng)相的話，鹽溶液可先單獨(dú)用水膜過濾)水膜：纖維素微孔濾膜，易溶于丙酮等中等極性有機(jī)溶劑，不易燃燒，可用于空氣測(cè)定之用，亦可用于乙醇或水液體過濾。纖維素膜:醋酸纖維素膜：可過濾低分子量的醇類、水

5、溶液、酒類、油類。硝酸纖維素膜：適用于水溶液、空氣、油類、酒類過濾。不耐酸堿，溶于有機(jī)溶劑。可進(jìn)行熱壓滅菌。醋酸纖維與硝酸纖維素混合酯膜：性質(zhì)類硝酸纖維素膜。但可適用于PH值310范圍，10%20%的乙醇，50%的甘油，30%50%的丙二醇等，而2聚山梨酯80對(duì)膜有顯著影響。微孔濾膜使用前，應(yīng)進(jìn)行清洗處理，用蒸餾水浸泡洗凈后裝于濾器內(nèi)，有機(jī)溶劑的過濾則用乙醇浸泡清洗。色譜樣品或試劑的過濾，若是水系的，蒸餾水洗凈浸泡后，再蒸餾水預(yù)過濾，若有機(jī)系過濾，最好先將本品在純甲苯和95%以上的乙醇中分別浸泡過夜，再純甲苯和純乙醇預(yù)過濾，徹底洗凈膜后使用。微孔濾膜正反：a）各向同性，不分正反面，對(duì)額定孔徑以

6、上固體微粒能起到絕對(duì)截留的作用。b）有正反面，亮光強(qiáng)的為反面，亮光弱的為正面，膜內(nèi)孔徑從正面到反面逐漸遞減。使用時(shí)應(yīng)將正面對(duì)著待濾液，即待濾液從亮光弱的一面流入，濾凈液從亮光強(qiáng)的一面流出，欲截留微粒相當(dāng)于經(jīng)歷了孔徑從大到小多層濾膜的阻截而不易堵塞，可顯著延長(zhǎng)使用壽命。使用時(shí)應(yīng)在膜處理前認(rèn)好正反面，（光線從側(cè)面照膜可以比較出），作上記號(hào)，入水后正面將難以分辨。有機(jī)膜尼龍（聚酰胺）微孔濾膜材料為脂肪族尼龍，有良好的親水性，耐適當(dāng)濃度的酸堿，不僅適用于含有酸堿性的水溶液，亦適用于含有機(jī)溶劑，例醇類、烴類、醚類、酯類、酮類，苯和苯的同系物，二甲基甲酰胺，二甲基亞砜等等，是適用范圍最廣的微濾膜之一。有機(jī)

7、膜入水后顯著變脆，入有機(jī)溶劑強(qiáng)度的減少則輕些。有機(jī)能濾水系，水系不能濾有機(jī)。有機(jī)相的選擇使用反相色譜柱可以有三種有機(jī)溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，需根據(jù)具體情況選擇。有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時(shí)紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強(qiáng)，所以在波長(zhǎng)低于240nm時(shí)，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長(zhǎng)下也可使用，但是在低于220nm時(shí)，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時(shí)須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫呋喃中加入水可以解決這個(gè)問題

8、，但它與色譜柱平衡所需的時(shí)間比甲醇、乙腈長(zhǎng)，而且其不愉快的氣味也是一個(gè)不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的最大優(yōu)點(diǎn)是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間?？紤]到理想溶劑的特點(diǎn)，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以首選的有機(jī)溶劑應(yīng)是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機(jī)溶劑的也較為常見。水相的選擇樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時(shí)普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個(gè)單位。在分析有機(jī)酸時(shí)，當(dāng)PH值低于3時(shí)，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8時(shí)，就需要緩沖液，因?yàn)榇薖

9、H值已經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對(duì)高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報(bào)道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失?？紤]到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液（PH=2.5）是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1%Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。1.3色譜柱現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相液相色譜柱，其中以C18和C8柱最為流行。這兩種色譜柱之所以運(yùn)用廣泛是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲

10、得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子，但C18和C8經(jīng)常是最好的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別但在我們實(shí)驗(yàn)室中以常使用的是C18柱。1.3.1柱子尺寸規(guī)格的選擇液相色譜分析時(shí)柱子選擇的另一個(gè)因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑(dp)的選擇。最常用顆粒直徑為5ym，但顆粒的直徑(dp)為3.0及3.5呵的也適合分析使用，但大多數(shù)色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5ym的色譜柱，因?yàn)檫@種色譜柱具有很長(zhǎng)的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且dp為3.0ym的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp為3.5ym的色譜柱。我們實(shí)驗(yàn)室使

11、用的是4.6mm*250mm,dp為5ym，伊利特hypeisilODS2的色譜柱，硅膠基質(zhì)上鍵合了C18為官能團(tuán)的色譜柱填料，是典型的高效液相色譜柱用填料，適合于分析非極性和中性樣品，包括酸性、中性及親脂性化合物。、伸闔00HPLC色材稲躊綽性不吋洛可爲(wèi)亍區(qū)拶樂一苧烷曉港手里吉追亍疔巴芻追束出色氓I手!三琶勻、伸闔00HPLC色材稲躊綽性不吋洛可爲(wèi)亍區(qū)拶樂一苧烷曉港手里吉追亍疔巴芻追束出色氓I手!三琶勻去;氾潔爲(wèi)立注百1.4其他因素選擇液相色譜的分析方法時(shí)，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因?yàn)闇囟茸兓?度，保留時(shí)間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性。在分

12、析時(shí)柱溫一般比室溫高一點(diǎn)（如35C）,因?yàn)榇藴匾卓刂?，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓?實(shí)際操作這里簡(jiǎn)單介紹一下重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室島津這里簡(jiǎn)單介紹一下重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室島津液相色譜儀及其相關(guān)操作2.1溶劑準(zhǔn)備：色譜純級(jí)別a）過濾一0.45ym濾膜（纖維素膜水溶液，尼龍、PTFE通用型）。b）脫氣一超聲5-10min,排除O2,N2等。保證流量準(zhǔn)確，提高色譜圖重現(xiàn)性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護(hù)色譜柱（填料氧化）。c）溶劑截止波長(zhǎng)最好避免如乙腈和水190nm,甲醇和乙醇210nm,等。d）緩沖鹽流動(dòng)相：需現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫密封保存最多3天；有機(jī)溶劑和緩沖鹽（水）混配流動(dòng)相，需低溫保存。e）溶

13、劑混溶性：建議用色譜純10%異丙醇o(jì)r水作為過渡溶劑。流動(dòng)相-最多可以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脫；灌注柱塞密封清洗液（sealwash）-般建議使用6-10%甲醇水溶液;針頭清洗液（needlewash綠色）-一般選擇80%甲醇和20%水玻璃容器必須使用超純水清洗；所有溶劑和溶液在使用前必須用0.45卩m的濾膜過濾，并至少超聲脫氣5分鐘；用潔凈的玻璃容器盛放溶液和流動(dòng)相，避免污染；2.2操作步驟2.2.1開機(jī)和平衡系統(tǒng)1接通電源，依次開啟穩(wěn)壓電源、A泵、B泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器、系統(tǒng)控制器，待自檢通過打開計(jì)算機(jī)電源排空操作：打開LC-20AT泵排空閥（逆時(shí)針90度以上），按Pu

14、rge鍵，泵開始排空運(yùn)行。（三分鐘自動(dòng)停止）然后關(guān)緊排空閥（順時(shí)針旋緊）或者開機(jī)之前，直接打開排空閥，聽到滴聲之后，關(guān)緊排空閥把吸濾頭放入流動(dòng)相瓶中，打開排液閥，按purge鍵排液23分鐘,purge完畢后關(guān)閉排液閥啟動(dòng)泵送液（流速開始不宜太高應(yīng)為正常分析流速的50%80%），此時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣器的purge操作（時(shí)間為1525分鐘）自動(dòng)進(jìn)樣器清洗液一般使用與流動(dòng)相比例接近的不含緩沖鹽的試劑也可以用甲醇：水=70：30或甲醇：水=1：1代替，觀察檢測(cè)器基線平穩(wěn)后即可做樣。（注意：a.如果使用前色譜柱中保存的流動(dòng)相為純甲醇或純乙腈，而新流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí)，應(yīng)先用純水沖洗色譜柱十分鐘左右再

15、使用流動(dòng)相，以免鹽析出損壞系統(tǒng)。b.如系統(tǒng)為正相和反相交換使用，應(yīng)先將所有管路用異丙醇清洗后再更換新流動(dòng)相使用）。2.2.2數(shù)據(jù)采集及分析1在桌面上雙擊labsolution圖標(biāo)進(jìn)入實(shí)時(shí)分析窗口在開機(jī)畫面中，UserID選中Admin，不需輸入Password，點(diǎn)擊OKA*:.ft09SIS冋上5曆評(píng)：wiA*:.ft09SIS冋上5曆評(píng)：wi心世界LCkAU-i血躍LcZMSiidi-RDn西JbM腰NatMDffrfflQ-：!LCKQPovtRunL65acU3ETiUiKXd.J”:kjkcbiKi!：TTbbi弄口好.妊Lii&i邨=FMWK世Jil工TgMmli.-r.QhnF3巧

16、匚.ooiPriHAridyriigi勺VefID|M*axi1翳BrAfTii*1.Taa*a-zrd:1a-arMytK.Edfcnr1Mp|虛少|(zhì)宀皿中ffcWnr畐dc3FctnCni.ftfrot-B*.i.議菇朋旦豐軾SariEwWLLGld-=3iV.WEyIt化Mem.F1cyv摘拝址I|&沖氐加1._JCL55-wjfl忡I閆llXBOIZwKjI日七ftH=M1曲間ft鼻-蟲diS:d42在左側(cè)助手欄給出了引導(dǎo)順序操作的圖標(biāo)3點(diǎn)擊Dataacquisition進(jìn)入采集數(shù)據(jù)編輯方法界面選中Normal（通用簡(jiǎn)單）或Advanced（高級(jí)詳細(xì)）項(xiàng)a）設(shè)定Pumps泵參數(shù)（Pum

17、ps泵參數(shù)：Mode控制方式，F(xiàn)low流速，B,C,Dconc各項(xiàng)濃度，PMax最大壓力）b)Oven柱箱參數(shù)(Oven柱箱參數(shù):Oven設(shè)定溫度，TMax最大保護(hù)溫度)v!L*uranbLBiiLaQ,ahn.taarl1*U1#:二|上Ft曰Tin*GNotCorwnoGtedwnM：.-uulh：ihT4|呂d二E%nti|UTTi+Fr-r|P+i-e-3：=vC.luro.:nn|r-wntrll-fcrP-nbLl-fl:二|上Ft曰Tin*GNotCorwnoGtedwnM：.-uulh：ihT4|呂d二E%nti|UTTi+Fr1或|LUMotConnectedTipIniLr

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19、J)匚gchnjJrissireVF1*7U.T-WpU*!-El*LuiXATiprL.viliaclJiClm3急裁色.曰CUSS叫|釗L2iiOijnan.野LCalutkm|也匸訕Tn.Mdg)點(diǎn)擊Method三DataAnalysisParameter編輯積分參數(shù):h)設(shè)置Width峰寬，Slope斜率，MinArea最小峰面積等等。新建方法推薦使缺省值，待分析完樣品后再設(shè)置此項(xiàng)參數(shù)，得到優(yōu)化的色譜數(shù)據(jù)結(jié)果后，將參數(shù)保存在當(dāng)前方法中i)保存方法：點(diǎn)擊File三SaveMethodas3“HahhodTh沁弭卅d*円|町0冃6卻5wmRis比如載3LaidEhodRa-*na!.Nb5

20、dib.-PrrfcSalmi.種憂rttrCk?Rcrccnr口或oBeet存葉時(shí)起sferhHH-0dHtaEiufMrtiID-sb5eySri.麗鬧C.ih：nQ.聰審皿|JlAdhT.bl-h*kqbAckvlyaa:!-6iiTIL-anma4jkLli!：CdJx闿rh同口LStfumtD*SflS卻窖FEQ*0扌*/曰列也ID.DO000QXih)運(yùn)行方法：點(diǎn)擊如圖圖標(biāo)(InstrumentOn/Off系統(tǒng)開/關(guān))i）單針進(jìn)樣分析：如圖點(diǎn)擊SingleStart圖標(biāo)j）編輯樣品參數(shù)：SampleID樣品信息，MethodName方法文件名,DataPath數(shù)據(jù)存儲(chǔ)路徑,Data

21、Name數(shù)據(jù)文件名,Vial樣品瓶號(hào)（無），Tray#架號(hào)（無），Injection進(jìn)樣量等,點(diǎn)擊OK后，開始進(jìn)樣操作。-碼口3-JjIClD*-IfILC：NfbtHwJ1皿LCfi.rnnsTfTd?uitwiOeiKirr&Qi1ilWilOrtVCoZhuvnmsnIE血irLtiilHL*bM-69K&FW曰|bnaliirrMrAPMnlH-E|rmri*-碼口3-JjIClD*-IfILC：NfbtHwJ1皿LCfi.rnnsTfTd?uitwiOeiKirr&Qi1ilWilOrtVCoZhuvnmsnIE血irLtiilHL*bM-69K&FW曰|bnaliirrMrAPMn

22、lH-E|rmri*liitdlFrooi3i3a=Lttui,AnalyEieOn;i-?n|LCTijEH|BspACr-lxF.匚En|C-as:wpl-ir|Hl*|ColpvnHw-aSkapurckUI-DM帕如L：MFHCign-PQ,tMhl.nfEn卜wTwfhS.1UT1|3SOQl10IblgTi?5+Z-E2Irian.5ffQ?Q電*騫IB賂百FF|J|i.r|型軻也m臉釀習(xí)f*_UvfH呼HnodLnii-nB-ArtMXcnHR*吐*也口F1eSlLV3T.hnjFtb.i4tHFlTahpaFifeLE1Uplcliril*S4tl匚btnti-r.ZLLT-i

23、hCDnnacii-j.a3taI.JCUiSWBihT|H5_CBOI.(aso*J：8S-!I酌sk）報(bào)告予覽和打印，點(diǎn)擊Top返回上級(jí)引導(dǎo)操作欄:亙亙L口g】CfcKiluBai.“|總LSMn中4：BalTrreArd.,.II磁*LfFmijijniW卒1財(cái)電r社JH17;世l）點(diǎn)擊PostRunAnalysis進(jìn)入數(shù)據(jù)后處理界面:亙亙L口g】CfcKiluBai.“|總LSMn中4：BalTrreArd.,.II磁*LfFmijijniW卒1財(cái)電r社JH17;世亙亙L口g】CfcKiluBai.“|總LSMn中4：BalTrreArd.,.II磁*LfFmijijniW卒1財(cái)電r社

24、JH17;世m(xù)）點(diǎn)擊report進(jìn)入報(bào)告界面:|豎Itpmimtiudju商irtfiq$fEMT-sbdtvb*vLa獨(dú)utI-xtHsfc到x函皇曠匚口|丁1”既1備1麗F-JKFrojictix:iJJC函皇曠匚口|丁1”既1備1麗F-JKFrojictix:iJJCsclad(.isuijlHdrdD;2KH-I0-上ZK3-ZG12Kt3-3-i52畑1卜上btkDeno.MtthcJriC-_QCTccJ.時(shí)roftJWhadJJApplyIfrLhtd亙亙L口g】CfcKiluBai.“|總LSMn中4：BalTrreArd.,.II磁*LfFmijijniW卒1財(cái)電r社JH17;世;盼椎|n）打開reportformat欄，然后點(diǎn)擊Data打開數(shù)據(jù)文件鶴ll.匚PiMtrunAnfliy(-iMhiki)-|Hep4Mt-oqZJkr亠If.旦-IfflXjDQ.-&衛(wèi)印VB*|M5SJ：-k.|-：i:iit齡咼鶴ll.匚PiMtrunAnfliy(-iMhiki)-|Hep4Mt-oqZJkr亠If.旦-IfflXjDQ.-&衛(wèi)印VB*|M5SJ：-k