膜片鉗技術(shù)以及應用

1、關(guān)于膜片鉗技術(shù)及應用第一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù) 向細胞內(nèi)注射恒定或變化的電流刺激，紀錄由此引起的膜電位的變化，這叫做電流鉗技術(shù)。在具體實驗中，可通過給予細胞一系列電流脈沖刺激，誘發(fā)細胞產(chǎn)生動作電位。第二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 電壓鉗技術(shù)是通過向細胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流，從而將細胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映離子流的大小和方向。第三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù) 膜片鉗技術(shù)與電流鉗、電壓鉗技術(shù)在命名上并不完全一致，后兩者是從電學概念的角度命

2、名的，而“膜片鉗”主要是從機械物理學的角度命名的。第四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù)從字面上理解，膜片鉗技術(shù)鉗制的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)處理的微電極與細胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細胞膜在電學上與其他細胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來。第五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù) 所以，膜片鉗技術(shù)是一種通過微電極與細胞膜之間形成緊密接觸的方法，采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對生物膜上的離子通道的電活動進行記錄的微電極技術(shù)。膜片鉗技術(shù)是一種特殊的電壓鉗/電流鉗技術(shù)。第六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù)用特制的玻璃

3、微吸管吸附于細胞表面，使之形成10100G的密封，被孤立的小膜片面積為m2量級，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對該膜片實行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布，并分析膜電位與離子濃度等之間的關(guān)系。第七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等。第八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月倒置顯微鏡、防震臺、屏蔽罩、三維操縱儀三維操縱儀倒置顯微鏡

4、第九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗放大器第十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗實驗流程膜片鉗實驗方法包括：制備玻璃微電極；制備細胞標本；建立高阻封接； 電流記錄。第十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月制備玻璃微電極拉制微電極材料：硼硅酸鹽毛細玻璃管。要求：玻璃毛胚外徑1.31.7，內(nèi)徑1.01.2，壁的厚度在0.2以上。管壁越厚，拉制出的電極尖端管壁也越厚，電極的跨壁電容就越小，噪聲也就越低。第十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月玻璃微電極及膜片的幾何形狀第十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電極拉制儀第十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)

5、作于2022年6月拉制方法：兩步拉制法。第一步：使玻璃軟化，并拉開一個距離，形成一個細管，即拉制電極的頸部；第二步：使用較低的熱度，拉斷細管部，成為兩個基本相同的玻璃微電極，此步控制電極的尖端。一般拉制出的玻璃微電極尖端直徑為15m。第十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月涂膠和拋光對玻璃微電極進行涂膠和拋光。 涂膠（疏水性涂料，如硅酮樹脂）主要是為了減小電極的跨壁電容。第十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月拋光儀 拋光是指將玻璃微電極靠近加熱的鉑絲，從而使電極尖端變光滑的過程。拋光主要目的是。防止電極尖端刺破細胞，利于高阻封接。第十七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6

6、月電極液的充灌 對于尖端較細的玻璃微電極，膜片鉗實驗中常用的方法是：在微電極尾部施加負壓使尖端充灌電極內(nèi)液，然后用注射器在微電極尾部充灌電極內(nèi)液，最后輕彈微電極桿步使其內(nèi)的氣泡排出。 充灌長度為電極的1/3。第十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月制備細胞標本 從理論上來講，膜片鉗實驗用的細胞標本可來自體內(nèi)各種組織細胞，只要細胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標本制備上，不同組織細胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機械分離以及清洗等步驟。第十九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月建立高阻封接 在顯微鏡下找到微電極，移動三維操

7、縱儀，使電極尖端接觸細胞，形成高阻封接。第二十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月建立高阻封接 高阻封接形成是進行膜片鉗實驗的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細胞膜形成封接的過程，可以采用軟件發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器上可見一直線。第二十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月高阻封接形成的電流圖第二十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù)四種基本記錄模式細胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜

8、表面上，形成高阻封接，在細胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制，高分辨測量膜電流，稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性，第二十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月全細胞記錄法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再給一個很小的負壓，將電極覆蓋的膜吸破，使電極內(nèi)與整個細胞內(nèi)相通，用這個方法可記錄進出整個細胞的電流。第二十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月內(nèi)面向外膜片(inside-outpatch) 高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到

9、“內(nèi)面向外”膜片。第二十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月外面向外膜片（Outside-out patch ） 在全胞記錄式的基礎(chǔ)上，拉開電極使之與胞體脫離，這是附在電極尖端的膜片又可自動地將電極尖端口封住。此膜片的外側(cè)面向外其是在全細胞記錄的基礎(chǔ)上改進而成。第二十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗技術(shù)的應用2008年，第二軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部生物物理研究所的研究人員采用膜片鉗和激光掃描共聚焦顯微鏡，同步實時系統(tǒng)觀察心肌細胞鈣離子的釋放。第二十七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原理 膜片鉗能獲得膜上鈣離子通道的離子電流，但不能對離子的移動進行實時定位， 不能定量分析離子濃度。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對鈣離子的移動進行實時定位, 但無法對單個離子通道的離子移動信號( 如單通道電流)進行分析。第二十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月大鼠心室肌細胞 L2型鈣通道電流(ICa,L )第二十九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 采用膜片鉗- 激光掃描共聚焦顯微鏡同步