gg基因工程的操作程序課件

1、第二節(jié) 基因工程的基本操作程序第1頁，共22頁?；蚬こ痰幕静僮鞒绦颢@取目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因檢測與鑒定第一步第二步第三步第四步第2頁，共22頁。一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中獲取目的基因1. 基因組文庫 將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。 受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。2. 部分基因文庫 受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如cDNA文庫。第3頁，共22頁。3. 基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DN

2、A用適當(dāng)限制酶切割許 多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫第4頁，共22頁。（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1. 原理 PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因為整個過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。第5頁，共22頁。2. 過程高溫變性（9095）低溫退火（

3、5560）中溫延伸（7075） 雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個過程不需要解旋酶。多次重復(fù)3.特點：指數(shù)形式擴(kuò)增第6頁，共22頁。（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成 當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。第7頁，共22頁。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子，即基因表達(dá)載體。（一）構(gòu)建目的 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)

4、定存在，并且可遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第8頁，共22頁。質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA第9頁，共22頁。1.用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出_。2.用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達(dá)載體的構(gòu)建第10頁，共22頁。 科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)

5、。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。 資 料:第11頁，共22頁。（二）構(gòu)建零件及其作用1. 目的基因2. 啟動子 RNA聚合酶識別和結(jié)合的一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)。第12頁，共22頁。3. 終止子 一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。4. 標(biāo)記基因 鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目

6、的基因的細(xì)胞篩選出來。第13頁，共22頁。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。 基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動植物細(xì)胞等。 第14頁，共22頁。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞2.其他方法（見教材P12“生物技術(shù)資料卡”）（1）基因槍法（2）花粉管通道法第15頁，共22頁。（二）導(dǎo)入動物細(xì)胞顯微注射技術(shù)含目的基因的表達(dá)載體動 物 的受 精 卵含目的基因的受精卵早 期胚 胎雌性動物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動 物顯微注射分裂分化移 植發(fā)育第16頁，共22頁。（三）導(dǎo)入微生物細(xì)胞2. 常用受體細(xì)胞 大腸桿菌（E.c

7、oli）1. 過程（1）制備感受態(tài)細(xì)胞：用Ca2+（CaCl2）處理細(xì)胞，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（2）重組DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合，完成轉(zhuǎn)化。Ca2+ 處理法第17頁，共22頁。四、目的基因的檢測與鑒定 目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢測、鑒定才能得知。 常用的檢測手段主要從分子水平和個體水平進(jìn)行。第18頁，共22頁。（一）分子水平1. 檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因 提取受體生物全部DNA適當(dāng)限制酶切割DNA片段用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術(shù)第19頁，共22頁。2. 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 提取受體生物的mRNA用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA） 檢測DNA利用的是DNA與DNA雜交，檢測mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。第20頁，共22頁。3. 檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 抗原抗體雜交技術(shù)提取受體生物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗