全部實(shí)驗(yàn)課件石蠟切片法

1、第四模塊 生物顯微制片技術(shù)生物顯微制片技術(shù)根據(jù)材料的性質(zhì)和制作法的不同，生物顯微制片技術(shù)可以分為切片法與非切片法兩大類： 切片法：徒手切片法；石蠟切片法；火棉膠切片法； 冰凍切片法等。 非切片法：包括整體封藏法；涂布法；壓片法等。 本模塊主要介紹石蠟切片法、冰凍切片法。石蠟切片法 從取材開始，到制成切片標(biāo)本為止，其間必須經(jīng)過以下各主要步驟： 一、取材 二、固定 三、洗滌 四、脫水 五、透明 六、透入與包埋 七、切片 八、貼片 九、染色 十、封藏實(shí)驗(yàn)十七 石蠟切片法（一）取材、固定、洗滌、脫水一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.理解取材、固定、洗滌、脫水各步驟的基本原理。 2.了解取材、固定、洗滌、脫水各步驟的注

2、意事項(xiàng)。 3.掌握取材、固定、洗滌、脫水各步驟的操作方法。 1. 取材：用于制片的動(dòng)植物材料應(yīng)選擇新鮮的，用陳腐材料制片，往往不能反映材料的真正情況。 2. 固定：固定是借助化學(xué)藥品的作用,使細(xì)胞組織的形態(tài)保存下來,不使其改變形態(tài)和變質(zhì)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 3.洗滌：洗滌是洗去滲入細(xì)胞內(nèi)部的固定液。因材料中的固定液有的會(huì)妨礙染色；有的會(huì)發(fā)生沉淀或結(jié)晶，影響觀察；有的會(huì)繼續(xù)作用，使材料變壞等。 4.脫水：材料經(jīng)洗滌后含有大量的水分，必須用脫水劑脫盡里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存。因?yàn)樗謺?huì)使材料分解，而且透明劑與水是不相混合的，只有在完全無水的情況下，透明劑才能完全透入。三、實(shí)驗(yàn)程序1取材

3、：用單面刀片切取材料（厚度不超過3mm的 立方體）、每人共切4小塊。 2固定：將已切好的組織放入10%的福爾馬林溶液中固定12-24小時(shí)。固定劑一般為組織塊體積的10-15倍。3洗滌：材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用紗布將管口扎緊，置于水槽內(nèi)，進(jìn)行流水沖洗。流水沖洗時(shí)間一般需要12-24小時(shí)。 4脫水：材料自低濃度至高濃度的酒精進(jìn)行脫水。一般經(jīng)50%、70%、85%、95%直至純酒精。每級停留約30分鐘至1小時(shí)。如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。 四、注意事項(xiàng) 1. 取材的注意事項(xiàng)： 材料應(yīng)新鮮； 動(dòng)作要迅速； 取病理材料時(shí)，應(yīng)加對照。 固定的注意事項(xiàng) 固定液以新配為好 ； 固定的

4、時(shí)間依材料的種類、性質(zhì)、大小等而定； 材料固定完畢，保存于加蓋的容器，貼上標(biāo)簽。 3. 洗滌的注意事項(xiàng) 洗滌的時(shí)間要依固定劑的種類而定； 固定液為酒精或酒精混合液，一般不沖洗； 含有鉻酸、重鉻酸鉀等，必須用流水沖洗； 長時(shí)間固定于福爾馬林的應(yīng)充分水洗。 4. 脫水的注意事項(xiàng) 脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分； 在更換高一級的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料，以免損壞； 在低濃度酒精中，每級停留時(shí)間不宜太長，防止材料解體； 在高濃度酒精中，每級停留的時(shí)間也不宜太長，防止材料變脆； 脫水必須徹底，否則不易透明。 五、作業(yè) 1.石蠟切片法包括哪幾大步驟？ 2.簡述取材、固定、洗滌、脫水

5、的基本原理及 其注意事項(xiàng)。 實(shí)驗(yàn)十八 石蠟切片法（二） 透明、透蠟、包埋 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.理解透明、透蠟、包埋各步驟的基本原理。 2.了解透明、透蠟、包埋各步驟的注意事項(xiàng)。 3.掌握透明、透蠟、包埋各步驟的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 1. 透明 是指利用透明劑既可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質(zhì)，將脫水劑替換出來，使石蠟?zāi)茼樌M(jìn)入材料中。 2.透蠟 是指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石蠟充分滲透。3.包埋 是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器內(nèi)，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蠟塊，以備切片。 三、實(shí)驗(yàn)程序 1透明：透明也是漸次由低濃度至高濃度。材料先在純酒精和

6、二甲苯各半的混合液浸1530分鐘，再轉(zhuǎn)入純二甲苯中透明（至透明為止），一般1530分鐘。 2透蠟：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石蠟等量的混合液中約30分鐘，然后進(jìn)入純石蠟中約4060分鐘，再換純石蠟一次約4060分鐘。 3包埋：從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，用溫鑷子夾取材料平放于紙盒底部，使之排列整齊。將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蠟的表面凝固，將紙盒慢慢浸入水中，待石蠟完全凝固（約30分鐘）后即可取出備用。 附：生物組織包埋機(jī)操作方法（演示）。包埋機(jī)四、注意事項(xiàng) 1.透明的注意事項(xiàng) (1)使用透明劑時(shí),要隨時(shí)蓋緊蓋子,以免空

7、氣中水分進(jìn)入； (2)更換透明劑，動(dòng)作要迅速； (3)材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，應(yīng)退回純酒精中重新脫水。 2.透蠟的注意事項(xiàng) (1) 動(dòng)物材料常用的石蠟熔點(diǎn)為52-56C； 植物材料為54-60C。 (2) 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低； 3.包埋的注意事項(xiàng) (1)包埋前應(yīng)先把必需的用具（恒溫箱、溫臺(tái)、紙盒） 準(zhǔn)備好。 (2)包埋用的鑷子要先放在溫箱中預(yù)熱。 植物組織的透蠟過程必須緩慢進(jìn)行，所須的時(shí)間比較長，約需1-2天。其法如下：將組織連同二甲苯一起倒入小蠟杯中；然后輕輕倒入溶解的石蠟。石蠟就在二甲苯的上層凝固起來。此時(shí)可將小蠟杯放在35-37C溫箱內(nèi)，使石蠟徐徐熔解到飽和為止，約需1-2天；將

8、蠟杯移入56-60C溫箱中，待石蠟熔解后，倒去含有二甲苯的石蠟，以后每隔1小時(shí)左右更換已熔的純蠟一次，共換純蠟2-3次即可進(jìn)行包埋。五、作業(yè) 1. 簡述透明、透蠟、包埋的基本原理及注意事項(xiàng)。 2. 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3. 交已包埋好的蠟塊。實(shí)驗(yàn)流程：1. 脫水：85%酒精（30分鐘）95%酒精（30分鐘）100%酒精（30分鐘）。 2. 透明：1/2純酒精+1/2二甲苯（20分鐘）純二甲苯中（ 1530分鐘，至透明為止）。3. 透蠟：材料透明后移入1/2二甲苯+1/2石蠟等量的混合液中(30分鐘)，然后進(jìn)入純石蠟中約4060分鐘，再換純石蠟中約4060分鐘(此部分操作在溫箱中進(jìn)行)。4. 包埋：

9、純石蠟注入包埋用紙盒中，取蠟杯，用溫鑷子夾取材料平放于紙盒底部，使之排列整齊。將紙盒慢慢地平放在面盆的水面，待石蠟的表面凝固后即可取出備用。 實(shí)驗(yàn)十九 石蠟切片法（三） 切片、貼片一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握切片、貼片的操作方法。 2. 了解切片、貼片過程中應(yīng)注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理 切片是把包埋好的材料塊用切片機(jī)切成所需厚度的切片帶。 貼片是用粘貼劑把切片平鋪貼在載玻片上，以便于染色。三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）切片切片前的準(zhǔn)備工作 （1）石蠟塊的固著：先將蠟塊用刀片切成方形或長方形，組織四周留下23mm寬的石蠟。點(diǎn)燃酒精燈，然后用烤熱的蠟鏟放在臺(tái)木和蠟塊之間，利用蠟鏟的溫度熔化兩者的蠟，把蠟塊粘附在臺(tái)木

10、上。 （2 ）整修：用單面刀片將蠟塊四周修整平行。 2.切片機(jī) 一般常用的為輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，這種切片機(jī)的夾物部分是上下移動(dòng)，前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動(dòng)。通過調(diào)整控制刀片厚度的微動(dòng)裝置就可以切出不同厚度的連續(xù)切片。 3切片的方法（1）將已固定修好的石蠟塊臺(tái)木裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。（2） 將護(hù)刀蓋推至打開位置。（3）搖動(dòng)快速進(jìn)退手輪，使石蠟塊與刀口貼近，但不超 過刀口。（注意：在轉(zhuǎn)動(dòng)手輪時(shí)，應(yīng)保證機(jī)頭在紅、綠線之間移動(dòng)。）（4）調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟 切片約成15-30度。（已調(diào)好）（5）調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般4-10微米。（6）一切調(diào)整好后就可以切片。此時(shí)

11、右手搖動(dòng)大手輪， 左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度以每分鐘40-50轉(zhuǎn) 為宜。（7）切成的蠟帶到20-30厘米時(shí)，右手用另一支毛筆將 蠟帶挑起，平放在蠟帶盤上。 （注意：靠刀面的一面較光滑朝下）。 （二）貼片 1取一清潔的載玻片，滴一小滴粘片劑于玻片中央， 用手指涂抹均勻。 2滴1-2滴蒸餾水于已涂粘片劑的載玻片上。 3用刀片割一小段蠟帶，放在水面上。注意蠟片光面 貼于玻片上。并使之偏玻片的一端，另一端貼標(biāo)簽。 4把玻片標(biāo)本置于展片臺(tái)上（溫度保持在40-45C）， 直到蠟片伸展攤平。 5展片后把玻片標(biāo)本編好記號(hào)，放在平盤上。 四、注意事項(xiàng) 1.要嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行切片。 2.切片刀刀口鋒利，應(yīng)

12、用時(shí)切忌手指觸及刀口,并 且防止切片刀跌落桌上或地面，以免發(fā)生刀傷事故。 3.切片機(jī)工作完畢，應(yīng)將大手輪處于鎖緊狀態(tài)， 此時(shí)機(jī)頭在最上端，將護(hù)刀蓋推至合并位置。 4. 及時(shí)清除廢蠟，保持設(shè)備清潔。 五、作業(yè)1. 簡述切片和貼片的方法。2. 簡述你在切片與貼片過程中遇到的問題及解決的辦法。 3. 選交5片玻片標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)二十 石蠟切片法（四） 染色、封藏一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 理解染色、封藏的基本原理。2. 了解染色、封藏的過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)。3. 掌握染色、封藏的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 1. 染色：細(xì)胞和組織的不同結(jié)構(gòu)之所以能被染成各種不同的顏色，是由于染料對它們所起的物理與化學(xué)綜合作用的結(jié)果。 (1

13、) 物理作用：如滲透作用、吸收作用、吸附作用等。 (2) 化學(xué)作用：是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)含有酸性和堿性物質(zhì)可分別與染料中的陽離子和陰離子互相結(jié)合，這種反應(yīng)使組織細(xì)胞染上顏色。 以常用的蘇木精-伊紅對染法為例：細(xì)胞核內(nèi)含有酸性物質(zhì)，易與堿性染料蘇木精中有染色作用的陽離子結(jié)合，細(xì)胞核被染上藍(lán)色。細(xì)胞質(zhì)含有堿性物質(zhì)，易與酸性染料伊紅中有染色作用的陰離子結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染上粉紅色。2封藏：封藏是使已經(jīng)透明的材料保存在適合折光率的封藏劑中，使材料能在顯微鏡下清晰的顯示出來，并能長期保存。 三、實(shí)驗(yàn)程序 1. 染色的一般方法 由于要染的切片包在石蠟之中，而所用的染色劑又常常為水溶液，因此在染色之前，必須再度復(fù)水

14、，石蠟切片在二甲苯中溶去石蠟，經(jīng)過各級酒精，下降至水，經(jīng)染色后需再脫水，上升到二甲苯透明然后封藏。 蘇 木 精伊 紅 （簡稱 H.E）對染法 (1) 二甲苯脫蠟 5-10 min。 (2) 二甲苯與純酒精等量混液 5 min。 (3) 純酒精，95%、85%、70%、50%酒精各2-5 min。 (4) 蒸餾水 2 min。 (5) 埃利希氏蘇木精染色液 60 min。 (6) 水洗 (換幾次，共約 5 min)。 (7) 1%伊紅水溶液15 min。(8) 50%酒精數(shù)秒。 (9) 70% 、85%、95%、純酒精各 2-5 min。(10) 純酒精與二甲苯等量混合液5 min。 (11) 二甲苯510 min。 (12) 封藏: 封藏于中性樹膠中。 2.