微生物代謝工程

1、微生物代謝工程代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使得目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵。代謝控制發(fā)酵的核心：解除微生物代謝控制機(jī)制，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。微生物代謝工程定義、研究?jī)?nèi)容和研究手段定義：應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶的功能或輸送體系的功能，甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能，以改進(jìn)細(xì)胞某些方面的代謝活性的整套操作工作(包括代謝分析、代謝設(shè)計(jì)、遺傳操作、目的代謝活性的實(shí)現(xiàn))。簡(jiǎn)而言之，代謝工程是生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾。研究?jī)?nèi)容：代謝流的定量和

2、定向細(xì)胞對(duì)底物的吸收和產(chǎn)品的釋放模型及分析研究胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法用13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析研究手段采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作基因工程技術(shù)的應(yīng)用。常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用。生物合成途徑的代謝調(diào)控生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測(cè)定。共合成法在生物合成中的應(yīng)用。酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏。無機(jī)磷對(duì)生物合成的調(diào)節(jié)。研究生物合成機(jī)制的常用方法刺激實(shí)驗(yàn)法。同位素示蹤法。洗滌菌絲懸浮法。無細(xì)胞抽提法。遺傳特性誘變法。工業(yè)發(fā)酵的五字策略(圖示加文字說明)進(jìn)，在育種和發(fā)酵控制方面都要促進(jìn)細(xì)胞對(duì)碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；通，在育種方面解除對(duì)某些酶的反饋調(diào)節(jié)，在發(fā)酵控制方面，誘導(dǎo)這些酶的合成或激活這些酶，從而使

3、來自各代謝物流(除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流)能夠暢通的注入載流途徑，匯入代謝主流，流向目的產(chǎn)物，特別是當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入目的產(chǎn)物合成階段后，必需確保載流路徑通暢，代謝主流優(yōu)勢(shì)明顯節(jié)，采用育種或發(fā)酵控制手段，節(jié)制與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物。這里所謂的“節(jié)制”是指封閉或削弱以目的產(chǎn)物合成途徑的起始底物或以中間產(chǎn)物為起始底物的分支途徑；堵，采用育種或發(fā)酵手段消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑，包括目的產(chǎn)物參與的分解代謝和合成代謝，為了消除或削弱目的產(chǎn)物的進(jìn)一步分解代謝，就必須降解目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的酶活力或酶量，甚至使這些酶不再合成或不起作用；出

4、，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。在育種和發(fā)酵控制發(fā)面可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)目的產(chǎn)物的通透性，增加輸送目的產(chǎn)物的載體蛋白的量，為目的產(chǎn)物輸送代謝能的方法，使目的產(chǎn)物盡快轉(zhuǎn)移出細(xì)胞。酶的阻遏機(jī)制，以大腸桿菌色氨酸或組氨酸操縱子為例來說明(圖示加文字說明)終端產(chǎn)物對(duì)其自身合成途徑的酶的合成的反饋?zhàn)瓒艉腿趸臋C(jī)制反饋?zhàn)瓒簦篧SiS2S3rF魅謚R1皿窯肇前工一LO岸于空物合愈的S8組氨酸操縱子：與His降解代謝有關(guān)的兩組酶類被稱為hut酶，控制這些酶合成的操縱子被稱為hutoperon。由一個(gè)多重調(diào)節(jié)的操縱子控制，有兩個(gè)啟動(dòng)子，兩個(gè)操縱區(qū)及兩個(gè)正調(diào)節(jié)蛋白。Hut操縱子共編碼4種酶和一個(gè)阻遏物。4種酶分別由hu

5、tG，hutH，hutl及hutU基因編碼，阻遏物則由hutC基因編碼。在產(chǎn)氣克氏菌中，以上基因構(gòu)成兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，hutl，hutG和hutU，hutH分別被轉(zhuǎn)錄合成兩條mRNA長(zhǎng)鏈。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位各自都有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)操縱區(qū)，其轉(zhuǎn)錄過程都是從左向右進(jìn)行的，hutC阻遏物能與每個(gè)操縱區(qū)相結(jié)合。無論以組氨酸作為唯一碳源或氮源，hut操縱子都會(huì)處于有活性狀態(tài)。Hut操縱子的每一個(gè)啟動(dòng)子上都有cAMP-CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)碳供應(yīng)匱乏時(shí)，能合成cAMP，出現(xiàn)cAMP-CAP復(fù)合物，并與操縱區(qū)上的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄。協(xié)同反饋抑制，以谷氨酸產(chǎn)生菌（棒桿菌或短桿菌）天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中反饋調(diào)節(jié)

6、為例來說明（圖示加文字說明）終產(chǎn)物的協(xié)同庭詡了抑制扎，犠武性1m鬟?artfe樺狀桿苗中孟門舞滅總族楓甚癮的合咸途徑和調(diào)節(jié)憤況tt臺(tái)咸;諭徑祥細(xì)踴中址ira用的上圖為谷氨酸棒桿菌中天門冬氨酸族氨基酸合成過程中的終產(chǎn)物的協(xié)同（反饋）抑制機(jī)理。協(xié)同反饋抑制是指在分支代謝途徑中，幾種末端產(chǎn)物同時(shí)都過量，才對(duì)途徑中的第一個(gè)酶具有抑制作用，若某一末端產(chǎn)物單獨(dú)過量則對(duì)途徑中的第一個(gè)酶無抑制作用的現(xiàn)象。天門冬氨酸族氨基酸合成起始于天冬氨酸，經(jīng)過兩個(gè)分支最終合成終產(chǎn)物賴氨酸、蘇氨酸以及甲硫氨酸，而終產(chǎn)物中賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同起來對(duì)該途徑第一步中的酶天門冬氨酸激酶具有抑制作用，這既為天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中協(xié)同

7、反饋抑制。營(yíng)養(yǎng)缺陷型和結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株（以賴氨酸產(chǎn)生菌為例）如何選育獲得（1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選與鑒定涉及下列幾種培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM）是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）是指可滿足某種微生物的一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長(zhǎng)需求的合成或半合成培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選一般要經(jīng)過以下四個(gè)環(huán)節(jié)。第一步，誘變劑處

8、理。第二步，淘汰野生型：在誘變后的存活個(gè)體中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的比例一般較低。通過以下的抗生素法或菌絲過濾法就可淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株即濃縮了營(yíng)養(yǎng)缺陷型。第三步，檢出缺陷型：具體方法很多。用一個(gè)培養(yǎng)皿即可檢出的，有夾層培養(yǎng)法和限量補(bǔ)充培養(yǎng)法；在不同培養(yǎng)皿上分別進(jìn)行對(duì)照和檢出的，有逐個(gè)檢出法和影印接種法?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室具體條件加以選用。第四步，鑒定缺陷型：可借生長(zhǎng)譜法進(jìn)行。生長(zhǎng)譜法是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物，視某營(yíng)養(yǎng)物的周圍有否長(zhǎng)菌來確定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。(2)結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株的選育過程確定結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)設(shè)計(jì)“篩子”a根據(jù)反饋

9、調(diào)節(jié)機(jī)制設(shè)計(jì)b.同時(shí)要考慮協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制等c.要考慮實(shí)驗(yàn)的成本問題d.根據(jù)問題多的輕重緩急設(shè)計(jì)確定結(jié)構(gòu)類似物劑量確定篩選的具體方法a.濃度梯度平板篩選法b.紙片法c.液體培養(yǎng)濃縮后涂布的方法高產(chǎn)株的檢出a.反饋調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)突變株：抗性b.輸送體系突變株：抗性c.影響與底物的親和能力的突變株：超敏性d.對(duì)入圍的突變株進(jìn)行產(chǎn)量形狀的篩選以初級(jí)代謝產(chǎn)物乙醇(利用包括葡萄糖等各種原料)或1，3丙二醇為例，簡(jiǎn)述微生物代謝設(shè)計(jì)育種方案答：以代謝產(chǎn)物為乙醇為例代謝育種方案的設(shè)計(jì)許多細(xì)菌、真菌和高等植物中都存在由丙酮酸生成乙醇的途徑，它為厭氧條件下的糖酵解途徑起著再生NAD+的重要作用。其中，丙酮酸脫羧酶(PDC

10、)催化丙酮酸的非氧化脫羧反應(yīng)，形成二氧化碳和乙醛；后者在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?。由于丙酮酸在糖酵解途徑中是個(gè)關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)，與草酰乙酸、乙酰輔酶A、乳酸等合成途徑均有密切聯(lián)系，因此可以采用工業(yè)發(fā)酵的五字策略，通過強(qiáng)化表達(dá)細(xì)胞內(nèi)PDC和ADH的活性來擴(kuò)增目標(biāo)途徑，阻斷副產(chǎn)物的形成路線，解除乙醇生物合成的代謝阻遏作用來提高菌株乙醇產(chǎn)量。代謝育種方案的實(shí)施菌種選定使用嗜溫或嗜熱性的梭菌屬由纖維素類物質(zhì)直接厭氧發(fā)酵乙醇，是生物能源再生的一種理想選擇，其優(yōu)點(diǎn)為代謝速率快，最終產(chǎn)物回收率高，細(xì)胞和酶系穩(wěn)定，并能直接轉(zhuǎn)化纖維素或戊糖。遺傳操作方案的制定這類細(xì)菌用于工業(yè)規(guī)模的乙醇發(fā)酵也存在兩大缺陷

11、：在乙醇發(fā)酵過程中往往伴有乙酸和丁酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，而且最終產(chǎn)物的最高積累濃度僅為3左右，由此則采用分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行改進(jìn)以提高乙醇產(chǎn)量。遺傳操作方案的實(shí)施利用DNA重組技術(shù)重新設(shè)計(jì)糖酵解途徑，阻斷副產(chǎn)物的形成路線，解除乙醇生物合成的代謝阻遏作用，同時(shí)提高細(xì)胞對(duì)高濃度乙醇的耐受性，是高產(chǎn)乙醇梭菌屬工程菌構(gòu)建的主要內(nèi)容。變異株培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)變異株培養(yǎng)條件的進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)盡量從生物學(xué)的角度安排試驗(yàn)，盡量排除培養(yǎng)基消毒、搖瓶培養(yǎng)條件不一致帶來的系統(tǒng)誤差，每批搖瓶試驗(yàn)都要做對(duì)照，注重產(chǎn)量與菌體量之間的的微妙關(guān)系。如何采用代謝工程進(jìn)行氨基酸(如賴氨酸或蘇氨酸)育種？答：以蘇氨酸產(chǎn)生菌育種為例代

12、謝育種方案的設(shè)計(jì)中心代謝流上節(jié)點(diǎn)的分析：在谷氨酸棒桿菌中，存在著由L-天門冬氨酸為起點(diǎn)產(chǎn)生L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑，整個(gè)途徑含有兩大節(jié)點(diǎn)：即由L-丁氨醛酸合成L-賴氨酸或高絲氨酸，以及由高絲氨酸合成L-蛋氨酸或L-蘇氨酸直至L-異亮氨酸。前一節(jié)點(diǎn)兩條途徑的代謝流選擇由高絲氨酸脫氫酶(HD)和二氫吡啶羧酸合成酶對(duì)其共同底物丁氨醛酸的相對(duì)親和性控制，這兩個(gè)酶的編碼基因分別為hom和dapA。在正常情況下，HD的底物親和性以及轉(zhuǎn)化率是其競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手二氫吡啶羧酸合成酶的25倍，因此碳源主要流向蘇氨酸-蛋氨酸生物合成途徑。但當(dāng)產(chǎn)生菌細(xì)胞內(nèi)蘇氨酸大量積累時(shí)，由于HD對(duì)L-蘇氨酸的變構(gòu)抑制作用極為

13、敏感，導(dǎo)致丁氨醛酸優(yōu)先進(jìn)入賴氨酸生物合成途徑。理想載流途徑的推定：谷氨酸棒桿菌的HD和高絲氨酸激酶(HK)由hom-thrB操縱子編碼，在hom編碼序列上游鄰近區(qū)域存在一個(gè)單一的啟動(dòng)子，L-蛋氨酸的阻遏作用可使這個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)的操縱子轉(zhuǎn)錄水平降低3倍。此外，在操縱子mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始密碼子之間還存在著一個(gè)衰減子結(jié)構(gòu)。為此根據(jù)L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑，采用工業(yè)發(fā)酵的五字策略，主要通過阻塞與目的產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物，以及消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑的方法提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。代謝育種方案的實(shí)施菌種選定谷氨酸棒

14、狀桿菌，優(yōu)點(diǎn)：工業(yè)中以廣泛應(yīng)用的菌株。遺傳操作方案的制定與實(shí)施提高野生型hom基因編碼產(chǎn)物HD的表達(dá)水平，緩和由于蘇氨酸變構(gòu)抑制作用而導(dǎo)致的酶活降低程度，或者直接用homdr突變基因代替生產(chǎn)菌中的野生型hom基因。在homdr出突變株中，同時(shí)克隆表達(dá)thrB和thrC基因，但轉(zhuǎn)化子在蘇氨酸的合成能力上并沒有新的突破?？寺”磉_(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。該酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物為草酰乙酸，它是L-天冬氨酸生物合成的前體，因此草酰乙酸的大量積累有助于L-天冬氨酸類氨基酸合成產(chǎn)率的提高。蘇氨酸合成的顯著流分被轉(zhuǎn)化成異亮氨酸或者進(jìn)一步降解為甘氨酸。蘇氨酸向異亮氨酸的轉(zhuǎn)化可通過同源交換構(gòu)建ilvA突變株而抑制

15、，而阻斷蘇氨酸到甘氨酸的降解途徑則是個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題，涉及到多個(gè)途徑，而且有關(guān)的基因在棒狀桿菌中尚未被鑒定。變異株培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)變異株培養(yǎng)條件的進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)盡量從生物學(xué)的角度安排試驗(yàn)，盡量排除培養(yǎng)基消毒、搖瓶培養(yǎng)條件不一致帶來的系統(tǒng)誤差，每批搖瓶試驗(yàn)都要做對(duì)照，注重產(chǎn)量與菌體量之間的的微妙關(guān)系。氨基酸生物合成的代謝流量分析涉及到哪幾方面的內(nèi)容？除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制和已知途徑的化學(xué)計(jì)量分析以外，穩(wěn)態(tài)代謝流量和流量動(dòng)力學(xué)分析對(duì)于理解氨基酸生產(chǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)也越來越重要。這涉及到提供碳架物質(zhì)、氧化還原當(dāng)量和代謝能的中心代謝途徑,也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代謝途徑。代謝流量分析和代謝流的

16、動(dòng)力學(xué)分析的一個(gè)主要目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)為的限速步驟。由于我國(guó)人多地少，在不爭(zhēng)或少爭(zhēng)口糧的前提下，如何建成12個(gè)綠色大慶？利用生物質(zhì)能源生產(chǎn)乙醇作為燃料木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的來源卻極其豐富且廉價(jià)，由于它不能被人體消化，因此不能用做食品工業(yè)的原料，也很難被轉(zhuǎn)化為發(fā)酵用的葡萄糖。木質(zhì)纖維素類物質(zhì)之所以被認(rèn)為是乙醇燃料生產(chǎn)的合適原材料，其原因還在于它可由生長(zhǎng)期較短的木材、農(nóng)業(yè)和林業(yè)的廢料（如作物秸稈和樹枝樹葉），以及各類廢棄物（如腐爛物、廢紙和市政固體垃圾）獲得。Zvmonitjftasttitibilix殛構(gòu)化_岌酵木搪異構(gòu)酶Suxh雖亦彈口spp.To.列珂山訕尿?qū)蟟s紐mm界?我國(guó)可以用

17、于生物質(zhì)能源生產(chǎn)的植物和原料很多，如糖質(zhì)原料（甘蔗、甜菜等）、淀粉（玉米、小麥、薯類等），目前已用于燃料乙醇的生產(chǎn)，以這些原料生產(chǎn)的燃料乙醇能力已達(dá)300萬(wàn)噸左右。充分利用現(xiàn)有土地與技術(shù)，生產(chǎn)的生物質(zhì)可轉(zhuǎn)化5000萬(wàn)噸酒精，接近兩個(gè)大慶的能源當(dāng)量。燃料乙醇原料生產(chǎn)既可使用玉米、小麥、薯類、秸稈等現(xiàn)成的農(nóng)產(chǎn)品，又可專門種植一些原料。利用發(fā)酵法利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的菌株可通過以下方法獲得酵母菌屬乙醇發(fā)酵途徑的改良利用基因重組工程技術(shù)改良酵母菌屬乙醇發(fā)酵過程使酵母菌能夠有效地將木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，而且這些克隆的木糖代謝基因的表達(dá)不再需要木糖誘導(dǎo)，也不為葡萄糖所阻遏。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中戊糖代謝途徑的引入*抑制tJILjW將乙醇合成基因引入腸道細(xì)菌，同時(shí)在天然乙醇生產(chǎn)菌株（如釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌）中引入來自其他微生物種屬的戊糖代謝途徑，這是構(gòu)建理想的乙醇生產(chǎn)菌的主要內(nèi)容。梭菌屬生產(chǎn)乙醇的可行性分析使用嗜溫或嗜熱性的梭菌屬由纖維素類物質(zhì)直接厭氧發(fā)酵乙醇，是生物能源再生的一種理想選擇，其優(yōu)點(diǎn)為代謝速率快，最終產(chǎn)物回收率高，細(xì)胞和酶系穩(wěn)定，并能直接轉(zhuǎn)化纖維素或