鏈霉素誘變育種方案

1、關于鏈霉素誘變育種的方案第一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月元芳!此事你怎么看?第二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月看目錄一、誘發(fā)突變 （一）、出發(fā)菌株選擇 （二）、誘變劑及誘變劑量的選擇 （三）、影響誘變效果的因素 （四）、平板分離二、突變株的篩選 （一）、初篩 （二）、復篩 （三）、產(chǎn)物活性測定三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選四、高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整第三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月插曲(很有必要)誘變育種的一般程序如下： 出發(fā)菌株-菌種純化(出發(fā)菌株性能測定)-制備斜面孢子-制備單孢子懸液(懸液進行活菌計數(shù))-誘變劑處理(存活菌數(shù)的測定并計算存活率)-平板分

2、離(測定變異率)-挑取變異菌落并移植至斜面上-初篩(初篩數(shù)據(jù)分析，生產(chǎn)性狀的粗測)-斜面?zhèn)鞔?復篩(復篩數(shù)據(jù)分析，精確測定生產(chǎn)性狀)-變異菌株(菌株參數(shù)分析)-小型或中型投產(chǎn)試驗-大型投產(chǎn)試驗。第四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一）、出發(fā)菌株的選擇選擇從自然界(土壤）中分離鏈霉菌 放線菌是產(chǎn)生抗生素活性最大的一類微生物，迄今已在工業(yè)、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)上都有利用抗生素成功的實例，而鏈霉菌又是放線菌中抗生素的主要產(chǎn)生菌，具有廣泛的物種多樣性和代謝多樣性，是重要的資源微生物，但在鏈霉菌中普遍存在遺傳不穩(wěn)定性，而引起抗生素產(chǎn)量下降。因此,我們要研究提高抗生素產(chǎn)量的方法，已期獲得更大產(chǎn)量的抗生

3、素，而提高產(chǎn)量的最重要途徑是通過育種改變生產(chǎn)菌種。誘變育種是一種簡便易行而且快速的選育方法，因而在抗生素的菌種篩選中應用最廣泛。一、誘發(fā)突變第五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月菌種的純化：1、土壤用無菌水浸泡，靜置取上清 2、做梯度上清分別稀釋10倍、100倍、1000倍等等 3、使用鏈霉菌優(yōu)勢培養(yǎng)基（在上邊鏈霉菌比其他菌長的快），用步驟2的各個梯度液體分別鋪板。 4、按照鏈霉菌最適生長溫度培養(yǎng)。 5、選取菌落數(shù)在100個左右，菌落清晰無重疊的平板。 6、根據(jù)伯杰氏菌種鑒定手冊中鏈霉菌的菌落外觀介紹，粗選出基本符合的鏈霉菌。7、挑取選出的菌落搖瓶培養(yǎng)，按照伯杰氏手冊做理化指標檢測。

4、8、符合伯杰氏手冊上理化指標的，提總DNA，做16SrDNA擴增，測序 9、測序結果在NCBI上blast，最終確定菌種第六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月鏈霉菌單孢子懸液的制備：所處理的細胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細胞，并且是均勻狀態(tài)的單細胞懸液，將121滅菌的無菌水加入到培養(yǎng)有鏈霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，(所處理的細胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細胞，并且是均勻狀態(tài)的單細胞懸液），將含有孢子的無菌水轉入三角瓶中，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在98以上的單孢子懸液。目的：在引起絕大多數(shù)細胞致死的同時，使存活個體中DNA的結構變異頻率大幅

5、度提高。第七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇該出發(fā)菌株的原因如下： 對誘變劑的敏感性高； 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； 可采用劃線分離法和稀釋分離法進行純化； 該菌株變異幅度廣； 該菌株穩(wěn)定性較好。第八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、誘變劑的選擇及誘變劑量的選擇選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線。 因為紫外線是一種使用時間長、效果好、設備簡單、值得推廣的誘變劑，大約有80%的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。紫外線的誘變育種 紫外線的作用機制是使兩個嘧啶之間聚合，形成嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。 紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為253

6、.7nm，燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。第九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月最適誘變劑量的選擇在誘變育種中有兩條重要的實驗曲線: 劑量-存活率曲線 劑量-誘變率曲線 通過比較以上兩曲線，可找到劑量-存活率-誘變率三者的最佳結合點。在實際工作中，突變率往往隨劑量的增加而提高，但到達一定程度后，再提高劑量反而會使突變率降低。根據(jù)UV、X射線和乙烯亞胺等誘變效應研究結果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負變較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中。因此，在誘變工作中，大多傾向于采用較低劑量（致死率在70-80%）。第十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6

7、月紫外線誘變的操作步驟：1將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，加入無菌生理鹽水洗滌再離心。 2將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液通過濾紙過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，使細胞數(shù)約為108個ml，作為待處理菌懸液。 3取24ml制備的菌液加到直徑7cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外燈預熱10min，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。第十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進

8、行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進行篩選。第十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、影響誘變效果的因素（1）菌種遺傳特性 各菌株因遺傳特性不同，對誘變劑敏感性也不一 樣。（2）菌體細胞壁結構 絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質會阻礙誘變劑滲 入細胞。（3）環(huán)境條件的影響 環(huán)境條件的影響包括： 誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng) 溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應的影響第十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的

9、材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，使鏈霉菌細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。如果劃線適宜的話，能將鏈霉菌細胞一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。并測定出其變異率（變異數(shù)與觀察總個體數(shù)的比值）。挑出變異菌落并移植至斜面上。 （四）、平板分離：第十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月分離后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突變個數(shù)極少，要從幾千萬個菌落中選出幾個好的，與自然選育中的篩選方法相同。可分為初篩（平板篩選、搖瓶發(fā)酵篩選)和復篩。篩選的方法：隨機亂向篩選 定向篩選突變是隨機不定向的，但是篩選是定向的，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定

10、菌種某些特性保留或淘汰的“篩子”。二、突變株的篩選第十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月初篩：以多為主，盡量擴大篩選范圍。復篩：以質和精為主，反復多次，結合自然分離，選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。多級水平篩選：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很低，而且實、驗誤差又很難避免，所以篩選工作中常用多級篩選，一利于優(yōu)良菌株的獲得篩選根據(jù)主次分為初篩和復篩第十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月平板菌落預篩 根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進行篩選和活性粗測的方法，大幅度擴大有效篩選量，提高篩選工作效率。搖瓶發(fā)酵篩選 優(yōu)點：不管種子或發(fā)酵過程的生產(chǎn)條件、生理條件如何，都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相

11、近，可以模擬進行。（一）、初篩缺點：在突變率小的情況下，如果菌落挑取少，很難篩選到理想的突變株第十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月對初篩出來的菌株進行復篩時，通常采用搖瓶培養(yǎng)法，一般一個菌株至少要重復35個瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測定。 復篩過程中，要結合各種培養(yǎng)條件進行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進行試驗。（二）、復篩第十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月篩選步驟如下：第十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1、步驟：搖瓶培養(yǎng)通常分為初篩和復篩，初篩因菌株多常常一株菌一瓶，進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后逐個進行活性測定，將生產(chǎn)性能高的菌株用沙土管或冷凍管保藏。

12、復篩時取出，以一株3-5瓶，振蕩培養(yǎng)后，測定活性，以提高精確性。2、優(yōu)點：培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐接近，這樣篩選出來的菌容易在大生產(chǎn)中推廣。搖瓶培養(yǎng):3、注意事項：搖瓶的條件要盡量與發(fā)酵罐接近。且各搖瓶間的培養(yǎng)條件要盡量一致（搖瓶型號，裝量，瓶塞厚度或瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉數(shù)，溫度）第二十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)基培養(yǎng)基脂肪酶產(chǎn)生菌透明圈法成色圈法果膠酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基生長圈法抑菌圈法嘌呤產(chǎn)生菌青霉素產(chǎn)生菌一、根據(jù)平板菌落生化反應篩選變株第二十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2037二、采用冷敏感菌篩選抗生素變株

13、第二十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月加入抗生素不加抗生素三、濃度梯度法篩選法第二十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四、復印技術快速篩選變株測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法蘇丹黑染色第二十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1五、瓊脂大通量篩選變株第二十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月200搖瓶液體培養(yǎng)寥寥無幾產(chǎn)物活性鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件調(diào)整正交實驗設計第二十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.瓊脂平板活性圈法 2.紙片法:發(fā)酵液濃度高時 3.瓊脂薄層紙片法 4.自動生化儀器分析法（三）、產(chǎn)物活性測定：第二十八張，PPT共五十六頁，

14、創(chuàng)作于2022年6月透明圈變色圈生長圈抑菌圈(水解酶、有機酸） (產(chǎn)酸菌)(工具菌+待檢菌)(抗生菌) 本組方案采用瓊脂平板活性圈法中的抑菌圈來測定其活性。第二十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月與營養(yǎng)缺陷突變有關的三類遺傳型個體 野生型菌株wild type strain 原始菌株營養(yǎng)缺陷型auxotroph 人工誘變或自然突變原養(yǎng)型菌株prototroph 回復突變或重組變異三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選第三十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月與篩選營養(yǎng)缺陷型有關三類培養(yǎng)基(1)基本培養(yǎng)基MM(2)完全培養(yǎng)基CM(3)補充培養(yǎng)基SM第三十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年

15、6月突變株的表型 檢出方法營養(yǎng)缺陷型 補充培養(yǎng)基（auxotroph） 抗性突變型 藥物培養(yǎng)基（resistant mutant）條件致死型 培養(yǎng)條件改變（conditional lethal mutant） 基因突變的類型第三十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月誘發(fā)突變淘汰野生型菌株檢出缺陷性鑒別缺陷性營養(yǎng)缺陷性菌株的分離和篩選第三十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇合適的誘變劑與誘變方法誘變劑和誘變方法都要簡便有效主要的誘變劑亞硝基胍,紫外線,亞硝酸誘變方法 物理方法 化學方法注意突變率還與誘變劑量有關（一）、營養(yǎng)缺陷性的誘變第三十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于20

16、22年6月1.抗生素法青霉素法（細菌）作用于細菌細胞壁的主要成分肽聚糖制霉菌法（酵母菌）作用于真菌細胞膜上的甾醇（二）、淘汰野生型菌株第三十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.菌絲過濾法適用于真菌和放線菌作用于絲狀菌的孢子3.高溫殺菌法適用于芽孢菌類作用于芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體第三十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、檢出營養(yǎng)缺陷型夾層培養(yǎng)法 限量補充培養(yǎng)法 影印接種法 逐個檢出法 第三十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1.夾層培養(yǎng)法（延遲補給法）第三十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.限量補充培養(yǎng)法第三十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于20

17、22年6月3.影印接種法第四十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月需要注意兩點第一 防止菌落擴散和蔓延，在培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉第二 為了克服孢子擴散而帶來不純現(xiàn)象，在操作方法上改進。第四十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4.逐個檢出法第四十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1 、鑒定方法一種方法是加入一種物質測定多株缺陷型菌株一種方法是測定一種缺陷型菌株對許多生長因子的需求情況稱為生長譜法（四）、營養(yǎng)缺陷型的鑒定第四十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟1測定缺陷性菌株所需生長因子的類

18、別2具體測缺陷該類別物質中的哪種因子3用單一因子進行復證試驗（一）、營養(yǎng)缺陷性的誘變第四十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月營養(yǎng)缺陷型生長譜法鑒定1. 氨基酸混合液； 2. 核酸堿基混合液； 3. 維生素混合液；營養(yǎng)缺陷型的鑒定第四十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月測定方法缺陷性菌株和基本培養(yǎng)基混合制成板，把生長因子分組直接點加于同一瓊脂平上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產(chǎn)生混合生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因子。缺陷性所需生長因子的測定第四十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月可用于微生物育種, 解除代謝反饋調(diào)控機制做為生產(chǎn)菌種雜交，重組育種時的遺傳標記基礎理論中，它被應用于闡明微生物代謝途徑營養(yǎng)缺陷性突變株的應用第四十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四、高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整第四十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共